彩色馬鈴薯“劍川紅”和“轉心烏”花色苷的抗氧化分析

肖繼坪，楊曉艷，郭華春*（云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201）

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彩色馬鈴薯“劍川紅”和“轉心烏”花色苷的抗氧化分析

肖繼坪，楊曉艷，郭華春*
（云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201）

摘 要：彩色馬鈴薯“劍川紅”和“轉心烏”富含花色苷，為探明2 種馬鈴薯中花色苷的體外抗氧化活性差異及其組合效果，使這種價格低廉、取材方便的食材得到更好的開發和利用。本研究以抗壞血酸（VC）為對照，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基法、2，2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基法、羥自由基（·OH）法、超氧陰離子自由基（O?·）法等4 種體外抗氧化模型評價了云南地方特色馬鈴薯品種 “劍川紅”和“轉心烏”花色苷的抗氧化活性。結果表明：“劍川紅”和“轉心烏”的花色苷具有很好的抗氧化活性，且與質量濃度成正相關，其清除自由基的能力是抗壞血酸的10.7～31.3 倍；“劍川紅”和“轉心烏”對4 種自由基的清除能力依次為ABTS+·＞DPPH自由基＞O?·＞·OH；“轉心烏”花色苷對4 種自由基的清除效果比“劍川紅”花色苷強；二者的花色苷之間沒有拮抗作用，且有一定的協同或增效作用，協同或增效效果因自由基的不同而有所差異。

關鍵詞：“劍川紅”；“轉心烏”；花色苷；抗氧化活性；自由基

引文格式：

肖繼坪， 楊曉艷， 郭華春.彩色馬鈴薯“劍川紅”和“轉心烏”花色苷的抗氧化分析［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 13-18.

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彩色馬鈴薯（colored potato or pigmented potato）是普通栽培馬鈴薯的變種，其塊莖的皮、肉呈現紅、橙、紫、藍、黑色［1］。云南具有豐富的彩色馬鈴薯品種資源［2］，“劍川紅”和“轉心烏”是分屬于紅色、紫色色系的云南地方特色馬鈴薯品種。“劍川紅”產于云南省大理州劍川縣，表皮光滑呈紅色，肉質白色帶紅色的環，口感細膩、香滑，淀粉含量較高。“轉心烏”則產于云南省宣威市寶山鎮，已有130多年的栽培歷史，薯形扁圓，塊莖周皮和木質部為紫黑色，木質部的紫色形成一個不規則的環向韌皮部蔓延，內外韌皮部和髓部均為淡黃色。兩種馬鈴薯均富含花色苷，且色彩鮮艷，產量高成本低，是大眾喜愛的蔬菜，甚至作為山區人民的主食，因此研究彩色馬鈴薯花色苷的功能對于深度開發利用彩色馬鈴薯和促進大眾健康都具有重要意義。

花色苷是一類具有生物活性的類黃酮物質，它除了能賦予植物艷麗的色彩外［3］，還具有抗氧化活性［4］。抗氧化性被視為花色苷的基礎生物活性，清除自由基這一作用與花色苷抑制炎癥反應［5］、預防心血管疾病、降血脂、保肝［6-7］、抑制腫瘤的發生等生理作用有關。花色苷是目前科學界發現的防治疾病、維護人類健康最直接、最有效、最安全的自由基清除劑之一，其清除自由基的能力是VC 的20 倍［8］。因此，研究彩色馬鈴薯花色苷的抗氧化活性是了解其他生物活性的基礎。

花色苷的結構是其生物活性的基礎［9］，花色苷的抗氧化能力是由花色苷結構的3 個因素，即羥基化程度、酰基和糖苷基類型共同決定的。首先，自由羥基個數與抗氧化活性成正相關，這意味著矮牽牛色素較錦葵色素、芍藥素和天竺葵色素具有更強的抗氧化能力［10-12］。其次，最常見的馬鈴薯花色苷酰化物是與香豆酸酰化的產物，酰化過程極大地增強了花色苷的抗氧化性［13］。此外，賦予彩色馬鈴薯抗氧化活性的糖苷基為芍藥色素糖苷基、矮牽牛色素糖苷基和錦葵色素糖苷基等［10，14］，“劍川紅”色素主要為酰化天竺葵色素類花色苷，“轉心烏”色素主要為矮牽牛色素，羥基化程度較高，糖苷基為矮牽牛色素糖苷基［15］。從結構上看，“轉心烏”花色苷的抗氧化能力要優于“劍川紅”，但目前此方面的研究很少。

因此，本實驗用酸醇提取法提取“劍川紅”和“轉心烏”的花色苷，并用標準曲線法測定其含量，以抗壞血酸（VC）為對照，測定二者花色苷清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基、超氧陰離子自由基（O·）和羥自由基（·OH）的能力，探明彩色馬鈴薯“劍川紅”和“轉心烏”花色苷的體外抗氧化活性差異及其組合效果，為開發以彩色馬鈴薯為原料的天然抗氧化劑和保健食品及消費者的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“劍川紅”和“轉心烏”為云南地方特色馬鈴薯品種，均以相同的栽培條件種植于云南農業大學后山農場，成熟后收獲塊莖作為實驗材料。

冰乙酸、無水乙醇、乙二胺四乙酸、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、抗壞血酸 天津市風船化學試劑科技有限公司；甲醇 重慶川東化工（集團）有限公司；鄰二氮菲西隴化工股份有限公司；十二水合磷酸氫二鈉 廣東光華科技股份有限公司；磷酸二氫鉀 廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；雙氧水 國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

Amberlite XAD-7大孔吸附樹脂 美國Sigma公司；DPPH、ABTS 東京化成工業株式會社；L-蛋氨酸SabaseBio公司；核黃素 北京索萊寶科技有限公司；硝基氯化四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）Biosharp公司。

1.2 儀器與設備

Heidolph LABOROTA 4000旋轉蒸發儀、CHRIST ALPHA 1-2型冷凍干燥機、TU-1810紫外-可見光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；AllegraTM64R離心機美國Beckman Coulter公司；LRH-250-G光照培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；SY3100DH超聲波清洗機上海聲源超聲波儀器設備有限公司；HH-4智能數顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器限責任公司；THZ-C恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花色苷提取純化和含量測定

花色苷提取：將收獲的新鮮馬鈴薯塊莖洗凈，陰涼處晾干，切成薄片。用體積分數為50%的乙酸-甲醇溶液密閉浸泡。24 h后倒出粗提液，再用等濃度的冰乙酸甲醇溶液浸提2 次。粗提液室溫過夜，沉淀淀粉，取上清液棉塞過濾后抽濾。40 ℃減壓濃縮后得粗提物浸膏，置于－20 ℃冰箱保存備用。

花色苷純化：將粗提物浸膏用蒸餾水稀釋后以每小時1 倍柱床體積的流速流過預處理好的XAD-7大孔吸附樹脂柱，加蒸餾水沖洗除去糖、蛋白質、無機鹽、有機酸等雜質，至流出液澄清，然后用2 倍柱床體積的體積分數為5%的乙酸甲醇溶液洗脫，收集乙酸甲醇洗脫液，于40 ℃減壓濃縮得提取物浸膏［15］，冷凍干燥成粉狀備用。

花色苷含量測定：采用標準曲線法測定提取物的總花色苷含量［16］，稱取矢車菊素3-O-葡萄糖苷標樣1 mg，加入提取液溶解配制成50 μg/mL的標樣。分別吸取50 μg/mL的標樣0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5 mL離心管中，提取液稀釋至4 mL，制成2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL的標樣。在535 nm波長處測定標樣的吸光度，以提取液為空白對照，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.033 8x+0.001 9（R2=0.999 1）。把彩色馬鈴薯花色苷凍干粉配制成1 mg/mL的提取物溶液，在535 nm波長處測定花色苷提取物溶液的吸光度，以提取液為空白對照，帶入回歸方程計算花色苷提取物的總花色苷含量。

1.3.2 抗氧化活性分析

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力的測定［17-18］

配制1 mmol/L的DPPH母液（準確稱取0.197 2 g DPPH，溶于500 mL純甲醇溶液中），放入－20 ℃冰箱中避光保存，使用前用甲醇稀釋成0.1 mmol/L DPPH工作液。將花色苷凍干粉末/抗壞血酸溶于去離子水中，配制成不同質量濃度梯度的花色苷溶液（2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL）、抗壞血酸溶液（50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL）。取0.15 mL花色苷溶液/抗壞血酸溶液，與4.35 mL DPPH工作液充分混勻為樣品組，以0.15 mL去離子水和4.35 mL DPPH為對照組，23 ℃避光反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度，每個樣品平行測3 次，計算DPPH自由基清除率及EC50值（concentration for 50% of maximal effect，EC50，即自由基清除率達到50%時所需要的樣品質量濃度）。

式中：A對照為DPPH自由基和溶劑的吸光度；A樣品為樣品與DPPH自由基反應后的吸光度。

1.3.2.2 ABTS+·清除能力的測定［17，19］

將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合均勻，放置黑暗處過夜反應，成為ABTS儲存液。使用前用體積分數為50%的乙醇溶液稀釋ABTS儲存液，在734 nm波長處檢測，使其最終的吸光度達到0.700±0.002，成為ABTS工作液（稀釋液大約是ABTS儲存液的40 倍，稀釋倍數隨儲存液貯存時間的增長而減小）。將花色苷凍干粉末/抗壞血酸溶于去離子水中，配制成不同質量濃度梯度的花色苷溶液（2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL）/抗壞血酸溶液（25、50、75、100、125、150、175、200 μg/mL）。取0.08 mL花色苷溶液/抗壞血酸溶液，與4 mL ABTS工作液充分混勻為樣品組，以0.08 mL去離子水和4 mL ABTS工作液為對照組，30 ℃水浴避光反應6 min，在734 nm波長處測定吸光度，計算ABTS+·清除率及EC50值。

式中：A對照為ABTS+·和溶劑的吸光度；A樣品為樣品與ABTS+·反應后的吸光度。

1.3.2.3 ·OH清除能力的測定［20-21］

將等濃度（0.15 mol/L）的Na2HPO4·12H2O和KH2PO4溶液混合，調其pH 7.40，得到濃度為0.15 mol/L pH值為7.40的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），用去離子水配制0.75 mmol/L的鄰二氮菲（先用適量的甲醇溶解后再用去離子水定容之所需體積）、0.75 mmol/L的硫酸亞鐵、0.01%的雙氧水。將花色苷凍干粉末/抗壞血酸溶于去離子水中，配制成不同質量濃度梯度的花色苷溶液（12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 μg/mL）/抗壞血酸溶液（100、200、300、400、500、600、700、800 μg/mL）。樣品組：1 mL PBS+1 mL鄰二氮菲+ 1 mL硫酸亞鐵+0.25 mL花色苷/抗壞血酸溶液，立即混勻后加入0.5 mL 0.01%雙氧水。損傷組：1 mL PBS+1 mL鄰二氮菲+1 mL硫酸亞鐵+0.25 mL去離子水，立即混勻后加入0.5 mL 0.01%雙氧水。未損傷組：1 mL PBS+ 1 mL鄰二氮菲+1 mL硫酸亞鐵+0.75 mL去離子水混合。37 ℃水浴避光反應60 min，在536 nm波長處測定吸光度，計算·OH清除率及EC50值。

式中：A樣品為樣品組的吸光度；A損傷為損傷組的吸光度；A未損傷為未損傷組的吸光度。

將等濃度（0.05 mol/L）的Na2HPO4·12H2O和KH2PO4混合，調其pH 7.80，得到濃度為0.05 mol/L pH值為7.80的PBS，用此PBS溶液配制65 mmol/L的L-蛋氨酸、100 μmol/L的核黃素、375 μmol/L的NBT、500 μmol/L的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液。將花色苷凍干粉末/抗壞血酸溶于去離子水中，配制成不同質量濃度梯度的花色苷溶液（8、16、24、32、40 μg/mL）/抗壞血酸溶液（200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL）。樣品組：1 mL PBS+1 mL L-蛋氨酸+1 mL乙二胺四乙酸+ 1 mL NBT+1 mL核黃素+0.1 mL不同質量濃度的花色苷/抗壞血酸溶液。對照組：1 mL PBS+1 mL L-蛋氨酸+1 mL乙二胺四乙酸+1 mL NBT+1 mL核黃素+ 0.1 mL去離子水。在溫度為25 ℃、光照強度為3 500 lx的光照培養箱中反應1 h。在560 nm波長處測定吸光度，計算O·清除率及EC50值。

式中：A對照為對照組的吸光度；A樣品為樣品組的吸光度。

1.3.2.5 “劍川紅”和“轉心烏”花色苷混合后的抗氧化活性的測定

根據“劍川紅”和“轉心烏”花色苷清除自由基的EC50值的質量濃度配制花色苷溶液，2 個品種的花色苷溶液各取一半混合成樣品溶液，用于4 種自由基清除能力測定。

1.4 數據處理

本實驗數據采用Excel 2007軟件進行處理，并計算EC50。

2 結果與分析

2.1 凍干粉中花色苷的含量

稱取1 mg凍干粉溶于1 mL去離子水中，配制成1 mg/mL的花色苷溶液。根據標準曲線法計算得出1 mg/mL的“劍川紅”和“轉心烏”花色苷溶液中所含的純花色苷質量濃度分別為7.9 μg/mL和4.5 μg/mL，即1 mg“劍川紅”和“轉心烏”凍干粉中含有純花色苷分別為7.9 μg和4.5 μg。為了比較兩種馬鈴薯中純花色苷的抗氧化活性的強弱，在后續的抗氧化活性實驗中，采用等質量濃度的凍干粉中所含的純的花色苷質量濃度測定。

2.2 “劍川紅”和“轉心烏”的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，“劍川紅”和“轉心烏”花色苷的DPPH自由基清除率隨花色苷質量濃度的增大而增大，當質量濃度達到16 μg/mL時，清除率分別高達81.0%和93.6%，且同質量濃度的“轉心烏”花色苷的DPPH自由基清除率要高于“劍川紅”花色苷。

同時，不同抗氧化劑的DPPH自由基清除能力強弱順序為：“轉心烏”花色苷（EC50=3.9 μg/mL）＞“劍川紅”花色苷（EC50=7.7 μg/mL）＞VC （EC50= 84.4 μg/mL），且“轉心烏”和“劍川紅”花色苷的DPPH自由基清除能力分別是VC的21.6 倍和10.9 倍。說明彩色馬鈴薯花色苷具有很強的DPPH自由基清除能力，抗氧化效果優于VC。

2.2.2 ABTS+·的清除能力

由圖2可知，“劍川紅”和“轉心烏”花色苷的ABTS+·清除率隨花色苷質量濃度的增大而增大，當質量濃度達到16 μg/mL時，二者的ABTS+·清除率均高達99.7%，且同質量濃度的“轉心烏”花色苷的ABTS+·清除率要高于“劍川紅”花色苷。

同時，不同抗氧化劑的ABTS+·清除能力強弱順序為：“轉心烏”花色苷（EC50=2.9 μg/mL）＞“劍川紅”花色苷（EC50=3.9 μg/mL） ＞VC（EC50=63.6 μg/mL），且“轉心烏”和“劍川紅”花色苷的ABTS+·清除能力是VC的22.1 倍和16.4 倍。說明彩色馬鈴薯花色苷具有很強的ABTS+·清除能力，抗氧化效果優于VC。

2.2.3 ·OH的清除能力

由圖3可知，“轉心烏”和“劍川紅”花色苷的·OH清除率隨花色苷質量濃度的增大而增大，當質量濃度分別達到20 μg/mL和30 μg/mL時，二者的·OH清除率分別高達91.3%和86.1%。當“轉心烏”花色苷質量濃度為20 μg/mL時，·OH清除率已達91.3%，而此時“劍川紅”花色苷的·OH清除率幾乎沒有。因此，“轉心烏”花色苷的·OH清除率要遠高于“劍川紅”花色苷。

同時，不同抗氧化劑的·OH清除能力強弱順序為：“轉心烏”花色苷（EC50=14.7 μg/mL）＞“劍川紅”花色苷（EC50=27.5 μg/mL）＞VC（EC50=295.3 μg/mL），且“轉心烏”和“劍川紅”花色苷的·OH清除能力是VC的20 倍和10.7 倍。說明彩色馬鈴薯花色苷具有很強的·OH清除能力，抗氧化效果優于VC。

2.3 “劍川紅”和“轉心烏”花色苷混合后抗氧化活性的變化

“劍川紅”和“轉心烏”花色苷分別以清除4 種自由基的EC50值等量混合，由圖5可知，對DPPH自由基、ABTS+·、·OH和O·的清除率分別增加了5.34%、5.44%、14.06%和11.13%。說明“劍川紅”和“轉心烏”花色苷之間沒有拮抗作用，且有一定的協同或增效作用，協同或增效效果因自由基的不同而有所差異。

3 結 論

“劍川紅”和“轉心烏”的花色苷具有很好的抗氧化活性，且與質量濃度成正相關；對4種自由基的清除能力：ABTS+·＞DPPH自由基＞O·＞·OH。“轉心烏”花色苷的抗氧化活性強于“劍川紅”花色苷，這可能是由 “轉心烏”和“劍川紅”主要花色苷結構上的差異造成。同等質量分數的“劍川紅”和“轉心烏”色素凍干粉清除4 種自由基的能力不如VC，但是通過對凍干粉中花色苷含量的測定，將其換算成純凈的花色苷復合物后，花色苷復合物清除自由基的能力是等量VC的10.7～31.3 倍，說明“劍川紅”和“轉心烏”花色苷具有很強的抗氧化活性。楊大毅等［8］的研究也表明花色苷是很強的自由基清除劑，其清除自由基的能力是VC的20 倍。

“劍川紅”和“轉心烏”花色苷混合后沒有拮抗作用，且有一定的協同或增效作用，協同或增效效果因自由基的不同而有所差異。本實驗分離純化得到的花色苷為混合物，雖然在前人研究基礎上進一步純化、定量，但具體的每個花色苷單體的作用機理及量效關系等還需進一步分離出純凈的單體后再進行研究。此外，馬鈴薯作為主糧和食品加工原料，其進一步的應用都需要加熱，所以彩色馬鈴薯在高溫高壓等條件下的抗氧化能力的變化亦值得深入探討。

Lachman等［24］對捷克和瑞士的15 個彩色馬鈴薯粗提液的花色苷含量進行了測定，在0.7～74.3 mg/100 g（以鮮質量計）之間。在自然界的天然植物中，彩色馬鈴薯花色苷的含量雖然不是最高的，但是彩色馬鈴薯具有適應性廣、產量高、易于保存和運輸、取材容易等特點，且彩色馬鈴薯所含花色苷多為酰化的花色苷，穩定性較高。因此，彩色馬鈴薯的花色苷可以應用于食品添加、化妝品、保健品等行業，具有廣闊的市場前景。

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中圖分類號：TS255.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0013-06

收稿日期：2015-08-12

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（31401439）；云南省教育廳科學研究基金項目（2013Y466）；國家馬鈴薯產業技術體系項目（CARS-10-P21）；云南省重大馬鈴薯種業專項（2013ZA007）

作者簡介：肖繼坪（1982—），女，講師，博士，研究方向為彩色馬鈴薯花色苷。E-mail：xiaojiping82@126.com

*通信作者：郭華春（1962—），男，教授，博士，研究方向為馬鈴薯栽培及生理生化。E-mail：ynghc@126.com

Antioxidant Activities of Anthocyanins from ‘Jianchuanhong' and ‘Zhuanxinwu' Pigmented Potatoes

XIAO Jiping， YANG Xiaoyan， GUO Huachun*
（College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract:This study comparatively evaluated the antioxidant activities of individual and combined anthocyanins extracted from the tubers of the red-skinned and red-fleshed potato variety ‘Jianchuanhong' and the blue-skinned and blue-feshed potato variety ‘Zhuanxinwu'， both of which are rich in anthocyanins as important natural antioxidants， with the aim of achieving better exploitation and utilization of these low-cost， easily available agricultural materials.The antioxidant activities were tested using four different in vitro models such as 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical，2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sμlphonate） radical （ABTS+·）， hydroxyl （·OH） and superoxide anion free radical （O?·）scavenging assays with vitamin C （VC） as a control.The results showed that anthocyanins extracted from ‘Jianchuanhong' and ‘Zhuanxinwu' potatoes had strong antioxidant activity in a concentration dependent manner and revealed a significant free radical scavenging capacity 10.7-31.3 times higher than that of VC.For both pigmented potato varieties， the capacity for scavenging four kinds of free radical revealed the following order: ABTS+· > DPPH radical > O?· > ·OH.The antioxidant activity of anthocyanins from ‘Zhuanxinwu' potato was better than that of ‘Jianchuanhong' potato.Anthocyanins from both varieties， in combination， were not antagonistic but were synergistic in scavenging free radicals， and the synergistic effects against different free radicals were different.

Key words:‘Jianchuanhong'； ‘Zhuanxinwu'； anthocyanins； antioxidant activities； free radical