蜂膠醇提物脂質體制備及表征

郭夏麗，藍雅惠，鄒藝紅，李 熊，羅麗萍*（南昌大學生命科學學院，江西 南昌 330031）

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蜂膠醇提物脂質體制備及表征

郭夏麗，藍雅惠，鄒藝紅，李 熊，羅麗萍*
（南昌大學生命科學學院，江西 南昌 330031）

摘 要：以大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用薄膜分散-動態高壓技術制備蜂膠醇提物（ethanol extract of propolis，EEP）脂質體，通過粒度分析儀、透射電子顯微鏡、清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、低溫貯存實驗等進行性狀表征。結果表明：制備的蜂膠脂質體為大小均勻的球形，粒徑為（78±14） nm，包埋率和穩定性分別達到（97.80±5.21）%和（2.53±0.05）%。4 ℃條件下保存90 d和180 d后，包埋率分別下降了16.74%和28.77%，分散系數分別增加了6.61%和14.32%，DPPH自由基清除指數分別為2.78和2.71；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析貯存180 d后EEP脂質體中7 種物質變化分別為1.08%～6.63%，低于EEP的5.55%～19.42%，說明脂質體對EEP中的活性物質具有一定的保護作用。

關鍵詞：蜂膠醇提物；脂質體；表征；穩定性

引文格式：

郭夏麗， 藍雅惠， 鄒藝紅， 等.蜂膠醇提物脂質體制備及表征［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 47-52.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613009. http://www.spkx.net.cn

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蜂膠是蜜蜂采集植物幼芽、樹皮與樹干裂縫處的樹脂，混入其上顎腺分泌物和蜂蠟咀嚼后加工而成的具芳香氣味的膠狀固體物［1］。其含有豐富的營養素和生物活性成分，如多糖、維生素、多酚類化合物、芳香酸及芳香酸酯、醛及酮類化合物、萜類化合物等［2-4］。蜂膠具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調節血脂與血糖、促進組織再生等廣泛的生物學作用［5-8］。近年來，食品行業對天然產物越來越感興趣，一方面可以從天然原料獲得生物活性化合物，另一方面可以利用天然產物生產穩定的功能產品［9］。蜂膠易因黃酮等活性物質氧化變性而失去活性［10］，氣味濃烈影響產品氣味［11］，目前主要采取乙醇提取法對蜂膠活性物質進行提取，得到的蜂膠醇提物（ethanol extract of propolis，EEP）由于在水相或油中不易分散［9］，從而影響其在日化產品、食品、藥物中的廣泛應用。脂質體是一種由磷脂在水中自組裝形成雙層膜小囊泡，對細胞膜親和性良好［12］，作為藥物載體具有靶向、高效、緩釋、副作用小等特點，已被廣泛應用于醫藥領域［5］。蜂膠中極性較強的物質包裹在脂質體的水相中，而一些極性較弱的脂溶性物質則包裹在脂質膜內，很好的阻止光、熱、氧氣和金屬離子等環境因素對蜂膠活性成分的破壞［13］。

關于蜂膠脂質體的制備研究，國內外都鮮有報道，僅有Fan Yunpeng等［14］將蜂膠黃酮、大豆卵磷脂、膽固醇、VE溶于乙醇-氯仿中，采用薄膜超聲法制備淫羊藿多糖-蜂膠黃酮脂質體，蜂膠黃酮最大包封率為85.48%，粒徑＜200 nm；湯志勇等［15］采用薄膜超聲法、逆向蒸發法、乙醇注入法3 種方法制備蜂膠脂質體，薄膜超聲法獲得最高包埋率85.7%的脂質體；吳亞妮等［16］采用乙醇注入法進行研究，發現制備得到的脂質體粒徑大、包封藥物易變性、乙醇難以除去等問題。動態高壓微射流技術（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一種新型連續化處理技術，它可將液體在極小空間進行強烈的垂直撞擊，形成持續高速的剪切力，從而將液體粒徑有效減小到分布均勻的納米級［17］，利用DHPM法和傳統的薄膜法結合來制備EEP脂質體，目前還未見到有類似報道。

為了阻止外界環境因素對蜂膠活性成分的破壞，本實驗以大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用薄膜分散-動態高壓技術制備EEP脂質體，考察EEP脂質體的理化性質和穩定性，包括形態學觀察、粒徑分布、包封率、貯藏穩定性等，通過清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力對EEP脂質體的保護能力進行評價和驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EEP浸膏：南昌大學生命科學學院自制。以1∶20（m/V）比例將青海大通蜂膠粉末溶于60%無水乙醇，于60 ℃水浴提取3 次，合并上清液后真空條件50 ℃旋轉蒸發至無水狀態。

大豆卵磷脂 荷蘭Lipoid Gmbh公司；碳支撐膜（銅網） 北京中鏡科儀技術有限公司；吐溫-80阿拉丁試劑（上海）有限公司；咖啡酸、表兒茶素、蘆丁中國藥品生物制品檢定所；山奈酚、p-香豆酸、阿魏酸 中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；3，4-二甲氧基肉桂酸、白楊素（純度≥95%）、膽固醇、DPPH美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；Microfluidizer Processor M-700微射流儀 美國Microfluidics公司；1200型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）（包括光電二極管陣列檢測器和G2170BALC化學工作站） 美國Agilent公司；Nicomp380 ZLS超細微粒粒度分析儀美國PSS粒度儀公司；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；JAC-300超聲波振蕩儀 濟寧市奧波超聲電氣有限公司；RE52-05旋轉蒸發儀、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；B13-3型磁力加熱攪拌器 上海司樂儀器有限公司；KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薄膜分散-動態高壓微射流技術（dynamic high pressure microfuidization，DHPM）［13］制備EEP脂質體

將大豆卵磷脂與膽固醇（總壁材368 mg）以質量比20∶3的比例溶解在20 mL無水乙醇中，45 ℃旋轉蒸發。加入20 mL pH 5.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），蒸餾水稀釋至50 mL旋轉蒸發40 min。將得到的脂質體懸液，用微射流均質機140 MPa條件下處理2 次，即得空白脂質體。

取一定量EEP與大豆卵磷脂（質量比280∶1）、膽固醇混合溶解于乙醇中，步驟同上，制備EEP脂質體。

1.3.2 EEP脂質體性質的測定

1.3.2.1 EEP脂質體形態及其粒徑和ζ電位、Ke值、包封率的測定

取蒸餾水稀釋適當倍數（卵磷脂終質量濃度為1 mg/mL）的EEP脂質體，滴加在培養皿中，將銅網浸入脂質體液滴中，4 min后濾紙吸干，用pH 6.0的磷鎢酸溶液對銅網進行染色4 min，室溫自然干燥，透射電子顯微鏡200 kV條件下觀察［18］。

采用NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀，角度90 °，溫度為（25±0.1） ℃，光波長為632.8 nm。樣品在測試前用去離子水稀釋10 倍。ζ電位的測量需每個樣品讀取10 次取平均值［19］。

將脂質體懸浮液于5 000 r/min離心10 min，用分光光度法測定脂質體懸浮液離心前后在415 nm波長處的吸光度，以蒸餾水為空白。按下面的公式計算穩定性參數Ke值［20］。

式中：A0和A分別為脂質體懸液離心前和離心后在415 nm波長處的吸光度。

蘆丁標準曲線繪制［21］：精密稱取干燥至恒質量的蘆丁標準品0.005 g于25 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，配成0.2 mg/mL的標準溶液。準確吸取0.1、0.2、0.8、1.6、3.2、6.4 mL標準液于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇至10 mL。各瓶加入0.5 mL 100 g/L氯化鋁水溶液，混勻，蒸餾水定容，室溫靜置15 min。以蘆丁空白溶液作對照，于415 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標，蘆丁終質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。

總黃酮含量的測定：準確吸取50 μL 10 mg/mL EEP于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇至10 mL，0.5 mL 100 g/L氯化鋁水溶液，蒸餾水定容，室溫靜置15 min，于415 nm波長處測定吸光度，結果以蘆丁質量計，單位為mg/g。

包封率的測定［17］：取一定量EEP脂質體懸浮液置于透析袋中，以pH 6.8的PBS為外液透析8 h。吸取透析內液加甲醇，超聲波振蕩充分破乳，離心后取上清液，測定其吸光度，通過蘆丁標準曲線計算總黃酮含量。取等量EEP脂質體懸浮液不經透析，直接加甲醇，超聲波振蕩破乳，離心后取上清液同上法計算總黃酮含量。

式中：m為EEP脂質體中總蜂膠的總黃酮含量/（mg/g）；n為包封的蜂膠總黃酮含量/（mg/g）。

1.3.2.2 HPLC法檢測180 d貯存期EEP脂質體中7 種物質的含量變化

取180 d貯存期的EEP脂質體用甲醇充分破乳后，4 000 r/min離心10 min取上清液，稀釋一定倍數過濾后，采用課題組之前研究HPLC的條件在280 nm波長處檢測咖啡酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、山奈酚、白楊素7 種物質的含量變化［22］。

1.3.2.3 EEP脂質體清除DPPH自由基能力［23］及其穩定性的測定

將EEP和包埋等量EEP的脂質體用甲醇分別釋成100、200、300、400、500、600 μg/mL樣液。取樣液0.1 mL，加入3.9 mL 0.1～0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液（現配現用），0.1 mL甲醇作空白。室溫黑暗條件下靜置90 min，于517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率的計算見下式。

式中：A0為空白體系在517 nm波長處的吸光度；As為樣品體系在517 nm波長處的吸光度。

IC50可通過DPPH自由基清除活性與樣品質量濃度的線性關系計算出，其抗氧化活性指數（antioxidant activity index，AAI）的計算見公式（4）。

式中：ρ為DPPH終質量濃度/（μg/mL）；IC50為50%抑制濃度/（μg/mL）。

將制備好的EEP脂質體置于離心管中，4 ℃條件下分別冷藏90 d和180 d，然后檢測脂質體粒徑大小、尺寸分布、包封率和多分散系數參數變化。

1.4 數據處理

利用Excel繪制各對照品標準曲線，獲得線性回歸方程及相關系數。所有實驗平行3 次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 EEP脂質體的包封率

根據蘆丁標準曲線，得出新鮮制備的EEP脂質體包封率為（97.80±5.21）%。湯志勇等［15］使用了3 種不同方法制備的蜂膠脂質體包封率為85.7%，張冰慧［24］制備的蜂膠脂質體包封率最高為90.69%。脂質體內包埋藥物量多少是衡量脂質體性能的最關鍵因素，而根據薄膜分散-DHPM法制備得到的EEP脂質體包埋蜂膠能力強，蜂膠在制備過程中損失極少，有利于蜂膠脂質體在保健藥物、食品添加劑等產品上的大規模應用。

2.2 EEP脂質體的形態

與蒸餾水對比，制得的EEP脂質體溶液為乳白色透明狀。由圖1可知，EEP脂質體外觀呈分散、單一的圓球形球粒，大小分布較均勻，粒徑＜100 nm，脂質體球體無明顯不規則結構及大規模聚集現象，這一特性有助于EEP脂質體添加至日化用品中生產中。

2.3 脂質體的粒徑和ζ電位

由圖2可知，制備的EEP脂質體粒徑主要分布在68～82 nm之間，EEP脂質體平均粒徑為78.60 nm，多分散系數（polydispersity index，PDI）即EEP脂質體粒徑方差，其平均值為0.353，ζ電位為－22.69 mV，以上結果驗證了透射電子顯微鏡的觀察結果，所制得的EEP脂質體粒徑較小，分散性好。ζ電位的絕對值越大，體系中顆粒之間的排斥力越大，則體系越穩定，絕對值越趨于零，顆粒之間可發生凝聚，生成比較大的絮體。但不能認為粒徑越小的脂質體就意味著該脂質體性能越好，而需要考慮在有較高包封率的前提下，制備有較高穩定性的EEP脂質體。

2.4 穩定性參數Ke值

離心過程中，比重小于分散介質的粒子將上浮，大于分散介質的粒子將下沉，從而引起穩定性參數Ke值的變化。Ke值越小，則體系的物理穩定性越好，反之則越差。本實驗制得的EEP脂質體Ke值為（2.53±0.05）%之間，小于張冰慧［24］通過優化實驗制得蜂膠脂質體的Ke值（（9.70±1.13）%），由此可見本實驗制得的EEP脂質體穩定性良好，說明EEP脂質體對包埋物質具有保護能力，防止EEP被氧化從而保持其活性能力。

2.5 清除DPPH自由基能力

注：y.DPPH自由基清除活性/%；x.樣品質量濃度/（μg/mL）。

Scherer等［25］指出當AAI＜0.5時，說明清除DPPH自由基活性不強，0.5＜AAI＜1.0時，活性適中，1.0＜AAI＜2.0時，活性較強，當AAI＞2.0時，則說明其活性很強。由表1可知，所有EEP和EEP脂質體都具有很強的清除DPPH自由基活性。通過比較新鮮的EEP和EEP脂質體，新鮮EEP的清除活性較強，可能是由于在制備脂質體的過程中EEP出現少量損失原因所致；貯存90 d和180 d的EEP和EEP脂質體中，均發現被脂質體包埋的EEP具有更強的清除DPPH自由基能力，從而驗證了脂質體對包埋物質的保護能力，防止EEP被氧化從而保持其活性能力。

2.6 HPLC檢測貯存180 d的EEP脂質體中7 種物質的含量變化

由圖3可知，貯存180 d的EEP脂質體中咖啡酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、山奈酚、白楊素含量較混合對照品分別下降了2.61%、3.43%、6.63%、1.47%、6.05%、1.08%和4.27%，而180 d 的EEP中相對應的物質含量分別下降了5.55%、11.35%、15.54%、15.38%、19.42%、9.32%和6.80%。對比兩者的物質含量變化，發現貯存180 d的EEP脂質體中物質含量明顯高于180 d的EEP，說明脂質體對包埋的EEP起保護作用，EEP脂質體中物質在貯存期間的含量損失比裸露EEP少。

2.7 脂質體的穩定性

貯存在4 ℃條件下90 d和180 d的EEP脂質體的包封率分別為（81.42±6.78）%和（69.66±10.01）%，平均粒徑分別為89.22 nm和97.63 nm（圖4），PDI值分別為0.378和0.412，ζ電位分別為－20.62 mV和－20.15 mV。結果發現，脂質體粒徑和PDI有所增大，可能是因為脂質體在貯存過程中，粒子之間發生相互碰撞而傾向于黏著在一起，進而團聚成更大的脂質體微粒，使得脂質體的分散系數變得更大，ζ電位絕對值降低，造成不均一性。經過90 d和180 d的貯存，EEP脂質體的包封率、粒徑、分散系數變化不大，顯示出薄膜分散-DHPM法制得的脂質體具有較好的穩定性。

3 結 論

本實驗采用薄膜分散-DHPM法成功制備蜂膠醇提物脂質體，制備的EEP脂質體粒徑在68～82 nm之間，包埋率高達（97.80±5.21）%，透射電鏡觀察結果為大小均勻的球體，且證明了4 ℃條件下貯存180 d的EEP脂質體都具有很強的DPPH自由基清除活性，HPLC分析EEP脂質體中的咖啡酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、山奈酚、白楊素7 種物質含量減少低于7%。蜂膠中黃酮類化合物是其主要成分和主要的抗腫瘤活性成分，脂質體作為抗腫瘤藥物的載體，能夠將抗腫瘤藥物選擇性地分布于體內癌變部位，既可提高癌變部位藥物濃度，從而提高藥效和藥物利用率，又可降低其對正常組織的毒副作用。EEP脂質體的成功制備克服了EEP穩定性差、水溶性差、氣味強烈等缺點，為蜂膠在保健食品中的應用提供了新原料。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613009

中圖分類號：S896.6

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0047-06

收稿日期：2015-10-11

基金項目：“十二五”農村領域國家科技計劃課題（2012BDA29B01-3）；江西省科技支撐計劃項目/江西省國際合作項目（20121BDH80020）

作者簡介：郭夏麗（1986—），女，助教，碩士，研究方向為植物資源開發與利用。E-mail：guoxiali2520@sina.com

*通信作者：羅麗萍（1972—），女，教授，博士，研究方向為植物資源開發與利用。E-mail：lluo2@126.com

Preparation and Characterization of Ethanol Extract of Propolis Liposomes

GUO Xiali， LAN Yahui， ZOU Yihong， LI Xiong， LUO Liping*
（School of Life Sciences， Nanchang University， Nanchang 330031， China）

Abstract:The thin film evaporation-dynamic high pressure microfluidization method was used to prepare ethanol extract of propolis （EEP） liposomes with soybean lecithin and cholesterol as membrane materials.The characterization of EEP liposomes was examined by dynamic light scattering particle size analyzer， transmission electron microscopy， DPPH radical scavenging activity assay， and low temperature storage test.The results showed that the average size of the liposomes obtained， evenly spherical in appearance， was （78 ± 14） nm， the encapsulation efficiency （97.80 ± 5.21）%， and the stability parameter Kevalue （2.53 ± 0.05）%.After the liposomes were incubated at 4 ℃ for 90 and 180 days， their encapsulation efficiency was reduced by 16.74% and 28.77%， along with a simultaneous increase in polydispersity index （PDI） of 6.61% and 14.32%， respectively.Moreover， antioxidant activity index （AAI） values for DPPH radical scavenging activity of the stored liposomes were 2.78 and 2.71， respectively.The contents of 7 compounds in the liposomes changed by 1.08%-6.63% after 180 days storage as revealed by HPLC analysis compared to 5.55%-19.42% in EEP.This study highlights the protection of liposome on EEP.

Key words:ethanol extract of propolis； liposome； characterization； stability