產洛伐他汀紅曲菌的篩選及中藥對其固態發酵的影響

車 鑫，毛 健，3，*，劉雙平，3，周志磊，3，薛景波（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000）

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產洛伐他汀紅曲菌的篩選及中藥對其固態發酵的影響

車 鑫1，2，毛 健1，2，3，*，劉雙平1，2，3，周志磊1，2，3，薛景波1，2
（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000）

摘 要：經洛伐他汀（Monacolin K）抗性平板篩選和固態發酵實驗驗證，從紅曲分離源中得到一株產洛伐他汀能力最強的菌株，并命名為M2-1，發酵12 d后其洛伐他汀產量可達1.472 mg/g（以干基計）。結合形態學特征和核糖體DNA內轉錄間隔區序列分析，將其鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）。考察15 種藥食同源中藥及其添加形式（藥粉、藥汁）對菌株M2-1固態發酵產洛伐他汀、色價等指標的影響，結果顯示：陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制備藥紅曲效果最佳（P＜0.05），其中陳皮粉紅曲和山楂汁紅曲的洛伐他汀和色價最高，分別為2.118 mg/g和320.12 U/g，分別較普通紅曲提高43.89%和71.79%。本研究發現多種中藥能夠促進紅曲菌產洛伐他汀和紅曲色素，為進一步提升傳統紅曲的藥食兩用功能提供了新的思路。

關鍵詞：紅色紅曲菌；中藥；固態發酵；洛伐他汀；色價

引文格式：

車鑫， 毛健， 劉雙平， 等.產洛伐他汀紅曲菌的篩選及中藥對其固態發酵的影響［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 114-119.

紅曲菌屬真菌（Monascus spp.）接種于大米，經固態發酵得到的制品即為紅曲［1］。紅曲是我國傳統的食藥兩用發酵產品，被廣泛應用于食品著色、酒類糖化發酵、肉類保鮮、降脂保健醫療等各個領域［2］。紅曲菌在發酵過程中能代謝產生紅素色素、水解酶類、洛伐他汀（Monacolin K）、麥角固醇、γ-氨基丁酸等多種有益物質［2-4］。其中，紅曲色素是一類天然、安全的食品著色劑，普遍存在于紅曲產品中，其有效成分通常以色價表示［5］；洛伐他汀為一種關鍵的降脂功效成分，臨床研究表明，洛伐他汀紅曲具有降脂效果顯著、無不良反應等優點［6-7］。然而，并非所有紅曲菌屬真菌都能代謝產生洛伐他汀，從目前報道來看［3］，主要以紅色紅曲菌（M.ruber）、紫色紅曲菌（M.purpureus）和叢毛紅曲菌（M.pilosus）3 個種為主，其野生菌株的洛伐他汀固態發酵產量一般在0.53～2.80 mg/g。

固態發酵因具有投資少、能耗低、產量高、環境污染小等優點，已得到世界各國的重視［8］。目前關于提高固態發酵產物產量的研究主要集中在菌種選育、培養條件優化和生物反應器選擇等方面［9-11］。近年來有學者研究發現一些外源添加物如中藥，能進一步較大幅度地提高真菌發酵代謝產物的產量：羅芳等［12］考察了21 種中藥對米曲制備的影響，發現紅景天、黃芪、西洋參對糖化酶活力和液化酶活力的提高效果最為顯著，提高率為36.76%～59.43%；崔培梧等［13］研究發現添加質量濃度為1 g/100 mL的黃芪、茶葉、麥芽、三七、葛根或穿心蓮，均能使茯苓菌發酵體系表現出極強的胞外多糖合成能力，認為植物藥能起到發酵調控作用；劉高強等［14］研究了5 種藥用昆蟲對靈芝多糖生物合成的影響，結果表明蜣螂在添加量為5 g/L時，雖不能促進靈芝細胞的生長，但卻能顯著促進靈芝多糖的形成（P＜0.05），提示蜣螂蟲粉中含有促進靈芝多糖形成的功能因子。可見，中藥的引入可為固態發酵調控提供一種新的策略和手段。另外，中藥本身具有一定的營養、風味和功能性成分，應用于發酵可以增加產品的附加值。例如我國一些釀造法制備的藥酒（如董酒）在糧醅拌曲發酵時加入藥粉或藥汁，不僅起到調控釀酒微生物發酵的作用，亦能提升酒體的香味和保健功效。綜上可見，中藥與固態發酵實踐相結合具有重要意義，而有關中藥影響產洛伐他汀紅曲菌的固態發酵目前未見報道。

曾有學者探討了中藥對釀酒紅曲固態發酵的影響［15］，結果表明，西洋參和紅景天能夠顯著提高紅曲酶活。借鑒該研究思路，本研究從我國傳統制曲用藥和相關文獻常見藥材中遴選出15 味藥食同源中藥，考察其對產洛伐他汀紅曲菌固態發酵洛伐他汀、色價等指標的影響，以期為深度開發藥食兩用紅曲提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基和藥材

1.1.1 紅曲樣品

從福建寧德、三明市，浙江溫州、麗水市和廣東梅州市采集11 份紅曲樣品。

1.1.2 培養基

分離和保藏培養基（g/L）：麥芽汁粉100、瓊脂20，自然pH值；察式酵母提取粉瓊脂（Czapek's yeast extract agar，CYA）培養基［16］；洛伐他汀抗性培養基（g/L）：可溶性淀粉5、蛋白胨1、瓊脂20、洛伐他汀0～800，自然pH值。以上培養基于0.1 MPa滅菌20 min。

固態發酵培養基：取35 g秈米用pH 5.0乳酸水浸泡2 h，瀝干后裝入250 mL三角瓶，8 層紗布封口后于0.08 MPa滅菌20 min，趁熱搖散米粒，冷卻至室溫備用。

1.1.3 中藥

白芷、丁香、茯苓、黑胡椒、肉豆蔻、杏仁、桑葉、甘草、赤小豆、牡蠣、枸杞、桑葚、麥芽、陳皮、山楂，均屬藥食同源藥材，購自無錫山禾集團中藥飲片有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ系列超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜系統（配有2489紫外檢測器及Empower 2色譜工作站） 美國沃特世公司；CX31RTSF顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 產洛伐他汀菌株的篩選

初篩：稱取紅曲樣品5 g至盛有95 mL帶玻璃珠的無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩20 min后取懸浮液0.5 mL進行梯度稀釋，取0.1 mL涂布于分離培養基，于28 ℃培養5～6 d，滅菌牙簽挑取單菌落轉至新的分離平板，相同條件下多次純化，結合顯微形態挑選具有紅曲菌基本特征的菌株［16］，于4 ℃斜面保藏。

復篩：使抗性培養基的洛伐他汀質量濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg/L，三點接種斜面保藏的菌株，于28 ℃倒置培養3 d，觀察菌落生長情況，選擇在高質量濃度洛伐他汀平板上生長良好的菌株。

固態發酵驗證：考察復篩菌株，以接種量105個孢子/g（以干基計）接種于固態發酵培養基；補加pH 5.0乳酸水使干基水分含量為0.8；搖瓶使培養基堆至瓶內一角，于28 ℃靜置培養2 d；用無菌藥匙將培養基搗散、攤平，以吸收瓶內水分；此后每24 h搖瓶1 次，直到第12天發酵結束。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定洛伐他汀產量，選擇產量高的菌株用于后續研究。實驗重復3 次取平均值。

1.3.2 菌株鑒定

個體形態觀察：采用載片培養法在25 ℃條件下培養7 d，用乳酸石碳酸棉藍染色液制成水浸片，高倍鏡下觀察受試菌的個體形態和結構。

菌落形態觀察：采用點種法將受試菌接種于CYA培養基，在25 ℃條件下培養7 d，觀察菌落特征，包括大小、顏色、表面質地、邊緣。

分子生物學鑒定：以受試菌總DNA［17］為模板，采用核糖體DNA內轉錄間隔區（internal transcribed spacer of ribosomal DNA，rDNA-ITS）通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，產物送至南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序。結果通過BLAST程序與GenBank核酸數據庫比對，選取同源性高的模式菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA5.0軟件進行多序列比對分析，以Neighbor-Joining法構建系統進化樹［18］。

1.3.3 藥紅曲的制備

藥粉準備：中藥于45 ℃烘干24 h，粉碎后取20～50 目細粉，0.8 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后于4 ℃冰箱保存。

藥汁準備：取上述藥粉4 g于50 mL離心管，加入20 mL去離子水，室溫浸泡4 h，0.8 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后5 000 r/min離心15 min，取上清于4 ℃冰箱保存。

固態發酵：取0.2 g藥粉或1 mL藥汁加入固態發酵培養基，按照1.3.1節固態發酵方法培養得到藥紅曲，測定發酵失質量、洛伐他汀產量和色價。實驗重復3 次取平均值，以不加藥的普通紅曲為空白對照。

1.3.4 指標測定

發酵失質量：稱量（精確至0.001 g）發酵起始培養基濕質量與發酵結束培養基濕質量，兩者之差即得發酵失質量。

洛伐他汀產量：采用HPLC法，準確稱取紅曲粉0.5 g置于50 mL比色管，加入體積分數70%的乙醇30 mL，50 ℃超聲提取1 h（250 W，40 kHz），搖勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜。色譜條件：色譜柱：Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%的磷酸水溶液（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：238 nm；進樣量：5 μL；柱溫：（30.0±0.5）℃。外標定量，結果以酸式洛伐他汀計。

色價：采用分光光度計法，參見國標GB 4926—2008《食品添加劑 紅曲米（粉）》。

1.4 數據分析

采用逼近理想點排序法（technique for order preference by similarity to an ideal solution，TOPSIS）對1.3.3節的數據進行綜合評價以確定最優藥紅曲方案。基于同向化、歸一化后的原始數據矩陣，找出理論最優、最劣方案，然后分別計算各評價方案與最優、最劣方案間的歐式距離，獲得各評價方案與最優方案的相對接近程度，以此作為評價優劣的依據［19］。顯著性分析采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1.1 菌株篩選結果

經梯度稀釋和分離培養基純化，從11 份紅曲樣品中獲得純培養菌株共計32 株，經顯微鏡檢初篩，得到9 株具有紅曲菌典型特征的菌株，命名為M1、M6、M8、M9、M11、M17、M2-1、M2-2、M3-1。接種于洛伐他汀抗性培養基，28 ℃培養3 d后，菌株生長情況有明顯差異（圖1）。以菌株M6、M8和M2-1為例，空白平板（左起第一列）所有菌株均能正常生長，抗性平板僅菌株M2-1能夠生長但長勢較空白平板稍差，但未發現受高質量濃度洛伐他汀抑制現象。結果表明，洛伐他汀會對真菌生長產生抑制作用，與此前的報道一致［20-21］；菌株M2-1對高質量濃度洛伐他汀不敏感，是高產洛伐他汀的潛在菌株，故選為目標菌株進行固態發酵驗證。

2.1.2 菌株產洛伐他汀的固態發酵驗證

以菌株M2-1固態發酵紅曲，采用HPLC精確定量洛伐他汀，以其他菌株為對照。由圖2可知，菌株M2-1的洛伐他汀產量為1.472 mg/g（以干基計，下同），顯著高于其他菌株，故確定菌株M2-1為供試菌進行后續實驗。

2.2 菌株M2-1的鑒定

2.2.1 菌落和個體形態學特征

由圖3a、b可知，在高倍顯微鏡鏡下觀察，菌株M2-1的閉囊殼呈球形，直徑45 μm左右，單生在菌絲上，由糾結的菌絲構成；菌絲具有橫隔，3～6 μm寬；分生孢子成串著生在菌絲頂端，倒梨形或球形。由圖3c可知，25 ℃條件下，在CYA平板上培養7 d后，菌株M2-1菌落直徑20～23 mm，放射狀，邊緣呈流蘇狀，褐色，平坦，表面質地叢卷毛狀。參照《真菌鑒定手冊》［22］和《紅曲菌的形態與分類學》［16］，菌株M2-1可初步鑒定為紅曲菌屬（Monascus spp.）。

2.2.2 分子生物學鑒定

2）自動化控制系統。地面控制系統均為撬裝OCS控制器獨立運行，地面壓力信號與現場井口BB井控系統進行聯鎖。當地面撬裝設備壓力高于設定值時自動關井，具有緊急關井聯鎖功能，從而確保運行安全可靠。地面各撬裝采用就地控制與中控室控制相融合，撬塊上的各重要工藝參數的顯示、控制、報警以及各相關邏輯聯鎖保護控制均由中控室DCS+PC系統進行遠程監控。

菌株M2-1的rDNA-ITS PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖4可知，產物條帶單一、明亮，說明特異性擴增良好，測序后得到長度為582 bp的序列，在NCBI上比對發現與紅色紅曲菌Monascus ruber FRR2447的同源性達99%以上，構建系統進化樹（圖5），菌株M2-1與Monascus ruber的親緣關系最近（相似度100%）。結合形態學特征，將菌株M2-1鑒定為Monascus ruber。該種是常見的三大紅曲固態發酵菌種之一［23］，具有較強的產洛伐他汀和紅曲色素能力。

2.3 中藥對紅色紅曲菌M2-1固態發酵的影響

2.3.1 對發酵失質量的影響

長時間的紅曲固態發酵過程中，底物經紅曲菌分解代謝后產生水和二氧化碳，水分蒸發和二氧化碳逸出造成質量損失，因此發酵失質量能夠反映紅曲菌的代謝活躍程度［24］。由圖6可知，與空白對照組相比，添加白芷粉/汁、丁香粉、茯苓粉、黑胡椒粉、肉豆蔻粉、桑葉粉、甘草粉、赤小豆粉、牡蠣粉、枸杞粉、桑葚汁、山楂汁紅曲的發酵失質量增加；添加茯苓汁、肉豆蔻汁、杏仁粉/汁、桑葉汁、甘草汁、牡蠣汁、桑葚粉、陳皮汁時發酵失質量降低；添加丁香汁、黑胡椒汁、赤小豆汁、枸杞汁、麥芽粉/汁、陳皮粉、山楂粉對發酵失質量影響不明顯。結果表明，15 種中藥材對紅曲菌的生長代謝有三方面作用：促進、無效和抑制，原因可能是中藥的多種成分綜合作用于菌體生長的結果［25］，其作用機制尚有待進一步研究。

2.3.2 對洛伐他汀產量的影響

由圖7可知，普通紅曲洛伐他汀產量為1.472 mg/g，添加白芷粉/汁、丁香汁、茯苓粉、黑胡椒汁、杏仁粉、桑葉粉、枸杞粉/汁、桑葚粉、麥芽粉、陳皮粉/汁、山楂粉/汁發酵對洛伐他汀的生成有促進作用，其中以陳皮粉效果最顯著（P＜0.01），達到2.118 mg/g，較普通紅曲提高43.89%；而添加茯苓粉/汁、黑胡椒粉、肉豆蔻粉/汁、桑葉汁、甘草粉、赤小豆粉、牡蠣粉、桑葚汁、麥芽汁發酵對洛伐他汀的生成有抑制作用；白芷汁、丁香粉、杏仁汁、甘草汁、赤小豆汁、牡蠣汁的添加對洛伐他汀的生成影響不明顯。上述結果表明，中藥種類與添加形式（藥粉、藥汁）均會對紅曲菌生長代謝產生影響，與李麗等［15］的研究結論一致。由于受試藥材本身不含他汀類物質，因此可判定紅曲洛伐他汀產量的提高來源于中藥的間接作用，其機理可能是中藥弱極性或非極性成分（如中、長鏈脂肪酸）使紅曲菌細胞膜通透性增加，從而有利于營養物質的攝取和洛伐他汀的分泌［26］，或是中藥的有效物質能影響生物合成途徑，有利于洛伐他汀的生成［27］。

2.3.3 對色價的影響

色價能在一定程度上反映紅曲色素含量的高低和著色能力的強弱。由圖8可知，添加白芷粉、丁香汁、黑胡椒汁、桑葉粉、陳皮粉、山楂粉/汁有利于提高紅曲色價，其中山楂汁的效果最為顯著（P＜0.01），達到320.12 U/g，較普通紅曲提高71.79%；丁香粉對紅曲色價無明顯作用；除以上藥材外，其他藥材的添加均會從不同程度上降低紅曲色價，說明在本實驗藥材的添加量下，抑制紅曲色素合成的因子起主導作用，但根據趙燕等［28］的報道，不排除有促進因子的存在，需通過改變添加量進行驗證。中藥對色價的影響相對洛伐他汀指標更加復雜，因為藥材成分除了可以間接作用于紅曲菌產色素外，一些藥材（如黑胡椒、陳皮、山楂等）自身的天然色素也可直接貢獻于紅曲色價；雖然枸杞紅色素在本實驗的低溫和酸性發酵環境下較穩定［29］，能夠對色價產生直接正效應，但可能不足以抵消枸杞中抑制因子產生的負效應，因此最終表現為降低紅曲色價；此外，紅曲色素的產生是一個耗氧過程［30］，而藥粉能夠疏松曲料，有利于氧氣傳遞，這可能是桑葉粉紅曲色價較高的部分原因。

2.3.4 確定最佳制曲藥材

注：Di+.評價方案與最優方案的歐氏距離；Di－.評價方案與最劣方案的歐氏距離；Ci.評價方案與最優方案的接近程度，Ci∈［0，1］，其值越大，評價結果越優。

TOPSIS法是一種優秀的多目標決策和多屬性評價方法，具有計算簡便、應用靈活的優點，在經濟、社會、科技、環境等領域得到了非常廣泛的應用［19，31］。根據圖5～7中的數據，利用該法對藥紅曲綜合評價。考慮到發酵失質量指標的增加會造成產品得率下降，故將其確定為低優指標，而洛伐他汀和色價顯然為高優指標。用藥方案的優劣按照Ci值排序，結果見表1。排序前7位藥紅曲的Ci值顯著高于普通紅曲（Ci＞0.555，P＜0.05），即陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉用于制備藥紅曲效果最佳。從藥材成分來看，這些藥材的纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等豐富的營養成分可被紅曲菌的酶系分解，用于菌體生長和產物合成；從中藥理論來看，這些藥材大多屬溫性，味苦、辛，與紅曲藥性相近而味相反，根據傳統制曲用藥規律［32］，促進真菌活動和抑制細菌繁殖的雙重作用可能是這些藥材制曲效果較好的原因。

3 結 論

洛伐他汀作為紅曲菌的次級代謝產物，會在一定程度上抑制其自身生長。本研究利用該原理從紅曲分離源中篩選得到一株對洛伐他汀抗性最強的菌株M2-1，經固態發酵驗證，發現其洛伐他汀產量也最高，該菌株能在較短的發酵時間內（12 d）發酵積累較高的洛伐他汀（1.472 mg/g），通過形態學和分子生物學鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）。

藥材種類和添加形式對紅色紅曲菌M2-1固態發酵影響顯著。通過TOPSIS綜合評價結果可知，陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制備藥紅曲的效果顯著優于普通紅曲（P＜0.05），其中，陳皮粉紅曲的洛伐他汀產量和山楂汁紅曲的色價最高，分別較普通紅曲提高43.89%和71.79%。本研究為進一步提高紅曲的降脂保健和著色效果提供了新的思路，對深度開發藥食兩用紅曲有良好的應用前景。此外，中藥添加量和復配作用會如何影響紅曲固態發酵，還需作進一步研究。

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中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0114-06

收稿日期：2015-09-10

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31571823）

作者簡介：車鑫（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：403995925@qq.com

*通信作者：毛健（1970—），男，教授，博士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：biomao@263.net

Screening of Monacolin K-Producing Monascus and Effects of Chinese Medicinal Herbal Materials on Monacolin K Production in Solid-State Fermentation

CHE Xin1，2， MAO Jian1，2，3，*， LIU Shuangping1，2，3， ZHOU Zhilei1，2，3， XUE Jingbo1，2
（1.School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine， Shaoxing 312000， China）

Abstract:One strain with the most powerful capability of producing Monacolin K named M2-1 was screened from red mold rice （RMR） using Monacolin K-containing plates and validated by solid-state fermentation.The yield of Monacolin K reached 1.472 mg/g （dry basis） after 12 d fermentation.The strain was identified as Monascus ruber by morphological and rDNA-ITS sequence analysis.The effects of powders and water extracts of 15 edible and medicinal herbs on Monacolin K production and color value of M2-1 in solid-state fermentation were studied.Results indicated that Pericarpium Citri Reticulatae， Fructus Crataegi， Folium Mori and Radix Angelicae Dahuricae powder as well as Fructus Crataegi， Flos Caryophylli and Fructus Piperis extracts significantly improved the quality of RMR （P < 0.05）.By adding Pericarpium Citri Reticulatae powder and Fructus Crataegi extract to the fermentation medium， the maximum Monacolin K production of 2.118 mg/g and the highest color value of RMR of 320.12 U/g were obtained which were increased by 43.89% and 71.79% compared those obtained with the ordinary strain， respectively.This study discovered a variety of Chinese medicinal herbs that could promote the production of Monacolin K and Monascus pigment by Monascus ruber， which will provide a novel strategy for improving the efficacy of traditional RMR as an edible and medicinal resource.

Key words:Monascus ruber； Chinese medicinal herb； solid-state fermentation； Monacolin K； color value