白鰱魚背側肌焦磷酸酶的純化及酶學特性

劉 瑋，徐 萌，張雅瑋，周 黎，馬志方，王復龍，彭增起*（南京農業大學食品科技學院，食品安全與營養協同創新中心，江蘇 南京 210095）

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白鰱魚背側肌焦磷酸酶的純化及酶學特性

劉 瑋，徐 萌，張雅瑋，周 黎，馬志方，王復龍，彭增起*
（南京農業大學食品科技學院，食品安全與營養協同創新中心，江蘇 南京 210095）

摘 要：通過粗分離、50%～80%飽和度硫酸銨分級沉降、DE-52陰離子交換柱層析等步驟，從白鰱魚背側肌中分離純化出焦磷酸酶。通過變性凝膠電泳分析，該酶在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中僅有一個分子質量為40 kD的條帶。酶學特性研究表明，白鰱魚背側肌焦磷酸酶可專一性地水解焦磷酸鹽，反應初速率時間范圍為0～15 min，最適反應溫度為45 ℃，最適反應pH值為7.5。Mg2+對該酶有明顯的激活作用，在Mg2+濃度為5 mmol/L時酶活力最高。5 mmol/L的Ca2+、Zn2+、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均對該酶有強烈的抑制作用。該酶水解焦磷酸四鈉的最大反應速率為0.051 U/mg，米氏常數為0.54 mmol/L。

關鍵詞：焦磷酸酶；純化；酶學特性；背側肌；白鰱魚

引文格式：

劉瑋， 徐萌， 張雅瑋， 等.白鰱魚背側肌焦磷酸酶的純化及酶學特性［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 130-135.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613023. http://www.spkx.net.cn

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焦磷酸鹽是魚糜制品加工中常用的一種添加劑，通常與其他多聚磷酸鹽復配使用，具有提高產品保水性的功能［1-4］。其作用機理類似于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的作用，能夠將肌動球蛋白解離成肌動蛋白和肌球蛋白，從而提高肌肉蛋白質的保水性［5-7］。然而，添加到肌肉中的焦磷酸鹽會被內源水解酶降解，弱化了焦磷酸鹽的功能與作用［8-11］。研究發現，這種內源水解酶是焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase）［12-13］。

Nakamura等［14］首次從兔骨骼肌中提取焦磷酸酶粗酶液，并發現有酸性焦磷酸酶和中性焦磷酸酶之分，最適pH值分別為5.2和7.4，但沒有將酶進行分離純化。隨后，Morita等［15］純化了兔肉中的中性焦磷酸酶，并進行酶學特性研究。目前，國內已有報道分別從雞肉、鳙魚、牛肉和豬肉中分離純化了焦磷酸酶，并研究其生化特性［16-19］。雖然肌肉焦磷酸酶的生化特性有一定的相似性，但是不同的物種之間仍存在較大差異，這將直接導致焦磷酸鹽在不同物種的肌肉中水解情況不同［20］。

白鰱魚是我國的一種大宗經濟型淡水魚類［21-22］，由于白鰱魚肉土腥味較重［23］，作為鮮魚銷售的商業價值不高，但白鰱魚肉顏色白嫩，因此常被用作加工魚糜制品的原料［24-25］。目前，對于白鰱魚中的焦磷酸鹽水解酶的分離純化及特性的研究未見報道。本研究以白鰱魚背側肌肉為原料對焦磷酸酶進行分離純化，并研究其酶學特性，對有效調控多聚磷酸鹽的水解，優化多聚磷酸鹽在魚糜制品加工中的功能效用有著理論意義和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

約1.5 kg新鮮白鰱魚7 條 南京衛崗農貿市場。白鰱魚宰后立即去內臟，取出背側肌，并剔除明顯的魚刺，冰浴中冷卻0.5 h待用。

焦磷酸四鈉（tetrasodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）、六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，HMP） 美國Sigma公司；陰離子交換層析填料DE-52纖維素英國Whatman公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 江蘇碧云天生物技術研究所；寬范圍的蛋白質Marker （10～250 kD） 美國Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreito，DTT）、考馬斯亮藍R250 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Waring Blender 8010ES高速度組織勻漿機 美國Waring公司；Allegra 64R高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；AKTA Prime Plus蛋白低壓層析系統 美國GE Healthcare公司；SpectraMax M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；蛋白電泳儀及凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase）的分離純化

焦磷酸酶的分離純化參考Gao Ruichang等［17］的方法并稍作修改。取400 g預冷的白鰱魚背側肌切成約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的塊狀物，加入4 倍體積25 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖提取液（含5 mmol/L MgCl2）勻漿1 min，10 000×g離心30 min得上清即為粗酶液。向粗酶液中緩慢攪拌加入研磨后的硫酸銨至50%飽和度，靜置4 h后，10 000×g離心30 min，留取上清并棄去沉淀。向上清液中繼續攪拌加入硫酸銨至80%飽和度，靜置4 h后，10 000×g離心30 min并取沉淀。用Tris-HCl緩沖提取液溶解后，用提取液充分透析（透析袋的截留分子質量為8 000～14 000 kD）24 h，更換5 次透析液。隨后，用DE-52陰離子交換柱（20 cm×1.6 cm）對酶進行純化，填料DE-52用提取緩沖液浸泡后裝柱，用pH 7.0 A液（25 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT）平衡，上樣5 mL，在穿刺峰出現后，以0～1 mol/L NaCl梯度濃度的B液（1 mol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT）進行洗脫，洗脫體積200 mL，收集主要的洗脫峰。測定蛋白質含量和酶活性后，收集純化的酶液，用超濾濃縮管（amicon YM-10超濾膜，截留分子質量為10 kD）5 000×g離心濃縮，于－80 ℃保存待用。以上操作在4 ℃條件下進行。

實驗采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。12.5%分離膠，4%濃縮膠，樣品進入分離膠前電壓為80 V，進入分離膠后電壓為100 V，用考馬斯亮藍R250染色。

1.3.2 蛋白質濃度測定

DE-52陰離子交換柱層析后的蛋白濃度用Bradford方法［26］測定，其余步驟的蛋白質濃度均用雙縮脲方法［27］測定。

1.3.3 焦磷酸酶活力測定

焦磷酸酶活力測定按照Yamazaki等［28］的方法并稍作修改。向50 μL焦磷酸酶中加入50 μL底物TSPP（含10 mmol/L MgCl2），于45 ℃反應15 min后，立即加入35 μL pH 7.0終止液（1.33 g/L SDS、0.12 mol/L EDTA），再加入265 μL顯色劑（0.05 g/L硫酸亞鐵、0.05 g/L鉬酸銨、0.5 mol/L硫酸）顯色，25 ℃水浴15 min，用酶標儀在640 nm波長處比色。對照組在添加底物TSPP前先加入終止液使酶變性，結束反應后與其他處理組同時加入底物TSPP和顯色劑。

一個酶活力單位定義為在pH 7.5、45 ℃條件下，每分鐘得到1 μmol產物Pi所需酶量。

1.3.4 焦磷酸酶的酶學特性

1.3.4.1 焦磷酸酶的酶促反應進程曲線

在pH 7.5、45 ℃條件下，測定每隔5 min反應時間時生成的產物Pi的量，以焦磷酸酶酶促反應時間為橫坐標，產物生成量為縱坐標制作反應進程曲線。

1.3.4.2 焦磷酸酶的底物專一性

分別以TSPP、STPP和HMP為底物，在pH 7.5、45 ℃條件下，按照上述方法測定焦磷酸酶活力并繪制酶促反應進程曲線。

1.3.4.3 底物濃度對焦磷酸酶活力的測定

在pH 7.5、45 ℃條件下，測定焦磷酸酶與不同濃度的TSPP（0.5、1、2、3、4、5 mmol/L）反應時的酶活力，將測得的最大值定為100%。

1.3.4.4 最適反應溫度及溫度的穩定性

在pH 7.5條件下，分別測定焦磷酸酶在不同反應溫度下（25、35、40、45、55、65 ℃）的酶活力，將測得的最大值定為100%。此外，將焦磷酸酶在不同溫度下（25、35、40、45、55、65 ℃）水浴1 h，冷卻至4 ℃后，測定酶活力，將4 ℃放置的焦磷酸酶的活力定為100%。

1.3.4.5 最適反應pH值及pH值的穩定性

在45 ℃條件下，分別測定焦磷酸酶在不同pH值的緩沖體系中（檸檬酸-檸檬酸鈉pH 4.0、5.0、6.0、6.5；Tris-HCl pH 7.0、7.5、8.0；甘氨酸-氫氧化鈉 pH 9.0）的酶活力，將測得的最大值定為100%。此外，4 ℃條件下將焦磷酸酶在不同pH值（4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0）條件下放置1 h，回調pH值至7.0后，測定酶活力，將測得的最大值定為100%。

1.3.4.6 Mg2+、Ca2+、Zn2+對焦磷酸酶活力的影響

在pH 7.5、45 ℃條件下，測定添加不同濃度的Mg2+、Ca2+和Zn2+（0、1、5、10、15、20 mmol/L，其中Ca2+和Zn2+中含有最適濃度的Mg2+）對焦磷酸酶活力的影響，將測得的最大值定為100%。

1.3.4.7 抑制劑對焦磷酸酶活力的影響

在pH 7.5、45 ℃條件下，測定添加不同濃度的EDTA-Na2、EDTA-Na4、KIO3、NaF對焦磷酸酶活力的影響，將未經抑制劑處理的酶活力定為100%。

1.3.4.8 焦磷酸酶反應動力學常數測定

測定當反應體系中TSPP終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol/L時焦磷酸酶的反應初速率。按照Lineweaver-Burk Plot雙倒數法作圖，得出最大反應速率vmax和米氏常數Km。

1.4 數據分析

實驗重復3 次，每個重復測定3 次。采用Origin 8.0軟件分析作圖。

2 結果與分析

2.1 白鰱魚背側肌焦磷酸酶的分離純化

從白鰱魚背側肌中提取的焦磷酸酶粗酶液，經初步分離、50%～80%硫酸銨分級沉降、DE-52陰離子交換柱層析等步驟得到純化，純化結果見表1。其中，層析洗脫曲線見圖1，在用NaCl溶液梯度洗脫之前，出現了一個蛋白穿刺峰（峰Ⅰ），這是一些沒有與柱子結合的蛋白組分。開始梯度洗脫后，在NaCl濃度約為0.18～0.40 mol/L的范圍和0.40～0.60 mol/L的范圍中出現了兩個洗脫峰（峰Ⅱ、Ⅲ），對相應的收集管內的蛋白組分進行酶活力測定后，發現第22、23、24、25、26管的酶活力較高，其余管的酶活力較低，峰Ⅲ中的蛋白組分幾乎沒有焦磷酸酶活力。因此，焦磷酸酶的活力成分主要為0.24～0.37 mol/L的NaCl洗脫出來的蛋白質組分。

表 1 白鰱魚背側肌焦磷酸酶的分離純化Table 1 Purification of PPasefrom silver carpdorsalmuscle分離純化步驟 酶總活力/U總蛋白質量/mg酶比活力/ （U/mg）純化倍數酶活力回收率/%粗酶液 8 184.27 19 373.08 0.42 1.00 100.00硫酸銨分級沉降、透析 5 871.09 11 276.86 0.52 1.23 71.74 DE-52陰離子交換柱層析 1 032.26 381.00 2.71 6.41 12.61

將粗分離、硫酸銨分級沉降和層析等主要純化步驟分別得到的焦磷酸酶樣品用SDS-PAGE測定，從圖2 SDS-PAGE圖譜中可見，經層析純化后的焦磷酸酶只在40 kD有一個條帶。該結果表明，分離純化后的焦磷酸酶不含雜質蛋白。

2.2 焦磷酸酶的酶學特性

2.2.1 焦磷酸酶的酶促反應進程曲線

在酶活力測定中，合理地選擇酶促反應時間是研究酶動力學性質的必要前提［16］。由圖3可知，在15 min時間范圍內，焦磷酸酶酶促反應產生的產物Pi含量與反應時間幾乎成正比。當時間延長至20 min，酶促反應進程曲線雖呈上升趨勢，但曲線的斜率不斷降低，說明反應的速率逐漸變慢。當反應時間繼續延長，不再有更多的Pi生成，反應趨于平穩。因此，本實驗選擇在0～15 min的初速率時間范圍內測定白鰱魚焦磷酸酶活力，這短于雞肉和牛肉的焦磷酸酶的初速率時間范圍（0～25 min）［16，18］。

2.2.2 焦磷酸酶的底物專一性

由圖4可知，以STPP和HMP為反應底物時，在30 min的反應時間內，二者被水解生成的產物Pi的含量很少。而白鰱魚背側肌焦磷酸酶對底物TSPP有著較強的水解能力，使得反應產物Pi大量生成。因此，白鰱魚背側肌焦磷酸酶對TSPP的底物專一性較強，這與前人的研究結果一致，雞胸大肌、牛半腱肌、豬背最長肌中的焦磷酸酶都能專一性地水解底物焦磷酸鹽［16，18，29］。

2.2.3 底物濃度對焦磷酸酶活性的影響

由圖5可知，在底物TSPP濃度較低的條件下（0.5～2 mmol/L），隨著底物濃度的增加，白鰱魚背側肌焦磷酸酶的活力不斷增加，在TSPP濃度為2～3 mmol/L時，焦磷酸酶的活力最高，而鳙魚背側肌焦磷酸酶的活力在底物濃度為5 mmol/L達到最大［17］。當TSPP濃度超過3 mmol/L時，白鰱魚背側肌焦磷酸酶的活力開始降低，當TSPP濃度為5 mmol/L時，焦磷酸酶活力僅為最高酶活力的67%左右，可見高濃度的底物可以抑制酶活力，這一趨勢與靳紅果等［29］的關于豬肉焦磷酸酶的研究一致。其原因可能是大量的TSPP與Mg2+結合［17］，導致Mg2+激活焦磷酸酶的能力下降。

2.2.4 最適反應溫度及熱穩定性

由圖6可知，白鰱魚背側肌焦磷酸酶的最適溫度為45 ℃左右，低于豬肉、鳙魚背側肌焦磷酸酶（50 ℃）和牛肉焦磷酸酶（47 ℃），高于雞肉焦磷酸酶（40 ℃）［16-19］。25 ℃條件下，焦磷酸酶的相對酶活力為55.4%。在25～45 ℃的溫度范圍內，焦磷酸酶的活力隨著溫度的升高而不斷變大，單位時間內反應物與酶的有效碰撞次數增加［30］。當溫度高于45 ℃時，焦磷酸酶活力又逐漸下降。在65 ℃時，焦磷酸酶活力僅剩余42.9%。該酶的熱穩定性隨處理溫度的升高呈劇烈下降的趨勢，45 ℃時其活力降至58.7%，當溫度達到55 ℃以上，焦磷酸酶幾乎完全失活，這說明高溫會使酶發生熱變性，對酶活力有強烈的抑制作用。

2.2.5 最適反應pH值及pH值穩定性

由圖7可知，白鰱魚背側肌焦磷酸酶最適反應pH值為7.5，稍低于鳙魚的焦磷酸酶（pH 8.0）［17］。該酶在pH 4.0～6.0的范圍內幾乎沒有水解活性，在pH 6.5～9.0范圍內酶活力呈先上升后下降的趨勢。焦磷酸酶對pH值的依賴性比較強。在中性范圍內（pH 7.0左右）保持較高的穩定性，在pH 4.0～6.5的范圍內幾乎完全失活。在強酸或強堿的條件下，由于電荷的排斥作用和離子鍵的減少會導致酶的結構發生變化，進而使酶失去活力［30］。由此可見該酶為中性焦磷酸酶，在肌肉中起主要水解焦磷酸鹽作用的酶也是中性焦磷酸酶［14］。

2.2.6 Mg2+、Ca2+、Zn2+對焦磷酸酶活性的影響

由圖8可知，適當濃度的Mg2+對焦磷酸酶有較強的激活作用，這與前人研究一致［16-19］。Leone等［31］報道，這一激活作用可能是由于Mg2+引發焦磷酸酶的構象發生改變，提高了酶的活力。當未添加Mg2+時，焦磷酸酶相對活力很低（2.0%左右）。而隨著Mg2+濃度不斷增加，焦磷酸酶的活力迅速提高，當Mg2+濃度達到5 mmol/L時酶活力最高。在Mg2+濃度高于5 mmol/L后，酶活力有所下降，但基本保持在80%以上，因此5 mmol/L為最適Mg2+濃度。而Ca2+和Zn2+則對焦磷酸酶有著強烈的抑制作用。當分別添加1 mmol/L的Ca2+和Zn2+后，焦磷酸酶的酶活力迅速下降，其相對酶活力分別為11.4%和5.4%。而當Ca2+和Zn2+濃度繼續增加，該酶幾乎完全失活。

2.2.7 抑制劑對焦磷酸酶活性的影響

抑制劑對白鰱魚背側肌焦磷酸酶活性的影響如表2所示，EDTA-Na2和EDTA-Na4對焦磷酸酶有強烈的抑制作用，分別向反應體系添加1 mmol/L的EDTA-Na2和EDTA-Na4后，焦磷酸酶的殘留活力僅為14.5%和7.9%，而當5 mmol/L的EDTA-Na2和EDTA-Na4存在時，該酶幾乎完全失去活性。Li Rongrong等［9］將100 g/kg的EDTA-Na2與雞胸肉斬拌勻漿發現，TSPP的含量在48 h內沒有發生變化，說明適當濃度的EDTA-Na2可以有效地抑制TSPP被焦磷酸酶水解。此外，KIO3和NaF也對焦磷酸酶的活力有抑制作用。5 mmol/L的KIO3存在時，焦磷酸酶相對酶活力僅為9.2%，低濃度（1 mmol/L）的NaF幾乎完全抑制該酶的活力，這與靳紅果等［29］的研究結果一致。

表 2 抑制劑對白鰱魚背側肌焦磷酸酶活性的影響Table 2 Effect ofinhibitorson the activityof PPase from silvercarpdorsalmuscle抑制劑 濃度/（mmol/L） 相對酶活力/% 無0 100.00±4.50 EDTA-Na21 14.50±2.99 5 0.63±1.25 EDTA-Na41 7.94±2.87 5 0.69±1.21 KIO31 24.63±2.02 5 9.19±0.50 NaF 1 2.25±1.50

2.2.8 焦磷酸酶的動力學常數

由圖9可知，白鰱魚背側肌焦磷酸酶的最大反應速率vmax為0.051 U/mg，米氏常數Km值為0.54 mmol/L。豬肉焦磷酸酶的Km值為0.36 mmol/L，鳙魚背側肌焦磷酸酶的Km值為1.98 mmol/L，這表明白鰱魚背側肌焦磷酸酶有較強的底物親和力。

3 結 論

純化的白鰱魚背側肌焦磷酸酶的SDS-PAGE圖譜中只有一個40 kD的條帶。白鰱魚背側肌焦磷酸酶專一性水解焦磷酸鹽，vmax為0.051 U/mg，Km為0.54 mmol/L，不能水解三聚磷酸鹽和六偏磷酸鹽；其反應初速率時間范圍為0～15 min。該酶的最適反應溫度為45 ℃，最適反應pH值為7.5，且在25～40 ℃之間及中性范圍（pH 7.0左右）保持較高的穩定性。Mg2+能明顯激活白鰱魚背側肌焦磷酸酶的活力，在5 mmol/L時酶活力達到最大值；而5 mmol/L的Ca2+、Zn2+、EDTA-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均會強烈的抑制該酶的活力。因此，當多聚磷酸鹽應用于魚糜及魚糜制品加工時，維持低溫、非中性條件，或添加一定量的Ca2+、Zn2+、EDTA-Na2等物質，可以有效地抑制焦磷酸酶活性、減緩焦磷酸鹽的水解，使多聚磷酸鹽發揮持久高效的作用。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613023

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0130-06

收稿日期：2015-10-09

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31271898）

作者簡介：劉瑋（1990—），女，碩士研究生，研究方向為肉制品加工與質量控制。E-mail：2013108012@njau.edu.cn

*通信作者：彭增起（1956—），男，教授，博士，研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn

Purification and Characterization of Pyrophosphatase from Dorsal Muscle in Silver Carp （Hypophthalmichthys molitrix）

LIU Wei， XU Meng， ZHANG Yawei， ZHOU Li， MA Zhifang， WANG Fulong， PENG Zengqi*
（Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition， College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract:Pyrophosphatase （PPase） was extracted and purified from silver carp （Hypophthalmichthys molitrix） dorsal muscle by crude extraction， 50%-80% saturated ammonium sulfate precipitation and DE-52 anion exchange column chromatography.The purified enzyme migrated as a single band with a molecular mass of 40 kD on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）.The enzymatic characterization showed that the purified enzyme could hydrolyze pyrophosphates， and the time range for its initial velocity was 0-15 min.The optimum temperature for the purified PPase was 45 ℃ and the optimum pH was 7.5.Mg2+was necessary for PPase activation and the activity reached up to the maximum value at Mg2+concentration of 5 mmol/L.The activity of PPase was strongly inhibited by 5 mmol/L Ca2+， Zn2+，EDTA-Na2， EDTA-Na4， KIO3or 1 mmol/L NaF.The kinetic constants vmaxand Kmof the purified PPase for tetrasodium pyrophosphate as substrate were 0.051 U/mg and 0.54 mmol/L， respectively.

Key words:pyrophosphatase； purification； enzymatic characterization； dorsal muscle； silver carp