野生蟬花多糖抗腫瘤活性及其作用機制

謝 飛，李 偉，陳美珍*，余 杰（汕頭大學理學院，廣東 汕頭 515063）

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野生蟬花多糖抗腫瘤活性及其作用機制

謝 飛，李 偉，陳美珍*，余 杰
（汕頭大學理學院，廣東 汕頭 515063）

摘 要：目的：研究野生蟬花多糖（wild Cordyceps sobolifera polysaccharide，CSP）體內外抗腫瘤活性。方法：以3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法考察不同劑量蟬花多糖體外對HeLa細胞的抑制作用，并以移植性S180實體荷瘤小鼠為模型檢測體內抗腫瘤活性，通過機體免疫系統各項生化指標的測定，初步探討其抗腫瘤作用機制。結果：當蟬花多糖質量濃度為400～800 μg/mL時，對體外培養的HeLa細胞具有抑制作用，并呈量效關系，當作用質量濃度為800 μg/mL時，抑制率達到61%。體內實驗表明，蟬花多糖高劑量組（200 mg/（kg·d））、低劑量組（100 mg/（kg·d））均有一定抗腫瘤活性。當多糖給藥劑量為200 mg/（kg·d）（以體質量計）時，對S180荷瘤小鼠抑瘤率達到42.9%；同時，荷瘤小鼠免疫器官指數顯著增大（P＜0.01），并激活淋巴細胞的增殖分化，對抗氧化應激系統具有較好的保護作用。結論：野生蟬花多糖在體內、外均有明顯的抗腫瘤活性，其原因可能與增強免疫調節能力及抗氧化活性有關。

關鍵詞：野生蟬花多糖；抗腫瘤活性；免疫調節；抗氧化

引文格式：

謝飛， 李偉， 陳美珍， 等.野生蟬花多糖抗腫瘤活性及其作用機制［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 209-213.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613038. http://www.spkx.net.cn

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蟬花（Cordycep scicadae）俗稱大蟲草，半翅目、蟬科蛁蟟的蛹被麥角菌科蟲草屬真菌寄生而形成的結合體［1］，蟲草屬，是一種具有很高藥食兩用價值的真菌，亦是我國傳統的中藥材。據報道［2-4］，蟬花具有免疫調節、滋補強壯、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化應激、降血糖及抗貧血等作用。溫魯等［5］測定了3 種蟲草樣品中蟲草酸、腺苷、蟲草多糖及蟲草素等活性成分的含量，結果顯示蟬花中蟲草酸和腺苷含量均高于冬蟲夏草，多糖和蟲草酸含量高于蛹蟲草，屬于優質蟲草，且具有2 種蟲草相近的醫療保健功效［5-6］。蘆柏震等［7］研究蟬花粗提物對PAA細胞株的作用發現，蟬花粗提物能選擇性殺傷G2（DNA合成后期）/M（細胞分裂期）期細胞，并顯著抑制PAA細胞生長。金麗琴［8］研究發現，蟬擬青霉孢子粉能顯著抑制體內外宮頸癌的生長。此外，蟬花總多糖對細胞免疫和體液免疫均有促進作用，能直接刺激小鼠脾細胞增殖，明顯促進刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠T、B淋巴細胞的增殖和免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體的生成，增強遲發型超敏反應［9］；亦可通過激活腹腔巨噬細胞、肺泡巨噬細胞，增強正常大鼠的吞噬與轉化功能，提高機體的免疫能力等［10］。

國內外有關野生蟬花的研究主要集中在有效成分的提取及小分子物質活性等方面，但對其抗腫瘤活性的研究鮮見報道。為此，本研究通過考察蟬花多糖體外對HeLa細胞增殖的影響，以及體內對S180荷瘤小鼠抑瘤作用、免疫功能的影響等，探討蟬花多糖的抗腫瘤作用，以期為更好地開發蟬花蟲草及其相關保健品、藥品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、細胞株與試劑

野生蟬花，取自廣東省河源市，由汕頭大學醫學院藥理學高分飛博士鑒定。

人宮頸癌HeLa細胞株、人腎上皮293T細胞株，由汕頭大學生物醫藥與先進材料研究中心提供。

高糖培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM） 美國Hyclone公司；胎牛血清 杭州四季青科技有限公司；胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液碧云天生物技術公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司；陽性藥物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU） 上海源葉生物科技有限公司；Con A 廣州市齊云生物技術有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物

S180腹水瘤小鼠（SPF級），購于廈門大學實驗動物中心。

1.3 儀器與設備

WFZ UV-2100紫外-可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；TDL-5M臺式大容量冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；JFSD-100型粉碎機 上海嘉定糧油儀器有限公司；ER-12A0型電子天平 日本Tokyo公司；SY-10數顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠；全波段掃描酶標儀 瑞士Tecan公司；倒置顯微鏡光學顯微鏡 日本Olympus公司；3111二氧化碳細胞培養箱 美國Thermo公司；高壓滅菌鍋 深圳市深安企業有限公司。

1.4 方法

1.4.1 蟬花多糖的微波超聲波協同提取

野生蟬花干品除泥，60 ℃烘干粉碎，40 目過篩，95%乙醇70 ℃條件下回流2 次，每次2 h，3 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀60 ℃真空條件下干燥，得蟬花粉末。取5 g蟬花粉末于55 倍體積蒸餾水中，依次經微波5 min、超聲波25 min處理后，4 000 r/min離心10 min取上清液。上清液濃縮后于3 倍體積95%乙醇中醇沉過夜，Sevag法多次除蛋白，依次經自來水、蒸餾水透析，冷凍干燥后得野生蟬花多糖樣品（wild Cordyceps sobolifera polysaccharide，CSP）。

1.4.2 CSP對HeLa及人腎上皮293T細胞的體外抑制實驗

1.4.2.1 采用MTT法分別測定CSP對HeLa［11］及293T細胞的體外抑制作用

分別取對數生長期的HeLa和293T細胞，胰酶消化后以含體積分數10%的胎牛血清DMEM培養液進行稀釋，制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，加入96 孔培養板中，每孔200 μL置于37 ℃體積分數為5%的CO2孵箱中培養過夜。實驗設給藥組，給予200 μL不同質量濃度（400、500、600、700、800 μg/mL）多糖的蟬花多糖溶液，同時設空白組（含體積分數10%的胎牛血清DMEM培養液）、對照組（細胞、DMEM完全培養基）和5-FU 陽性藥物組（25 μg/mL 5-FU），給藥后繼續培養48 h。培養結束前4 h，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，37 ℃培養箱中培養4 h，吸出上清液后加二甲基亞砜200 μL，微量振蕩器振蕩5 min，使深藍色沉淀物完全溶解，自動酶標儀于490 nm波長處進行檢測，分別按下式計算多糖對細胞的抑制率。

式中：A0為對照組吸光度；A1為給藥組吸光度；A 為空白組吸光度。

1.4.2.2 HeLa細胞的形態學觀察

將5×104個/mL的HeLa及293T細胞接種于96 孔板中培養，待細胞貼壁后，小心棄去培養基，用不同質量濃度（400、500、600、700、800 μg/mL）的蟬花多糖作用液200 μL分別處理HeLa細胞48 h，對照組加入等量DMEM完全培養基，48 h后于倒置顯微鏡下觀察HeLa細胞的形態變化，并拍照。

1.4.3 蟬花多糖體內抗腫瘤實驗

1.4.3.1 S180荷瘤小鼠模型的建立［12］

S180瘤株在小鼠體內腹水傳代3 次，每次7 d。無菌條件下，抽取最后1 次荷瘤小鼠腹水，用預冷的無菌生理鹽水調整細胞濃度至1.4×107個/mL，在小鼠左前肢腋下接種0.2 mL瘤細胞懸液。

1.4.3.2 分組與給藥

小鼠自由攝食飲水適應喂養3 d后，按體質量隨機分為5 組，各組體質量無顯著差異，每組12 只，即空白組、模型組、5-FU陽性藥物組、蟬花多糖低劑量、高劑量組。

實驗第1天，除空白組外，各組小鼠接種0.2 mL S180瘤細胞懸液，以建立腫瘤模型。接種24 h后開始給藥，其中陽性藥物組腹腔注射20 mg/（kg·d）（以體質量計，下同） 的5-FU；高、低劑量組分別灌胃200、100 mg/（kg·d）的CSP溶液；空白組和模型組灌胃等量生理鹽水。連續給藥8 d，每天1 次，飼養過程中，小鼠自由攝食飲水，并對小鼠的體質量、精神狀態等方面變化進行觀察。

1.4.3.3 樣本處理及抑瘤率的計算

實驗第10天結束給藥，小鼠稱體質量，眼眶取血脫頸處死，3 800 r/min離心10 min，分離血清，無菌條件下解剖剝離出瘤塊、肝、脾、胸腺等器官稱質量；血清于－20 ℃冰箱保存；腫瘤組織固定于4%甲醛后，4 ℃冰箱保存。

1.4.4 蟬花多糖對荷瘤小鼠免疫功能的影響

1.4.4.1 免疫器官指數的測定

肝臟、胸腺、脾臟指數的計算見下式。

1.4.4.2 荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖能力的測定

采用MTT法檢測脾淋巴細胞增殖能力［13］。無菌條件下取脾組織制成單細胞懸液，將其溶于2 mL完全培養基并稀釋至2×106個/mL。細胞懸液加入96孔培養板中，每孔200 μL，每樣做4 個復孔，3孔分別加入5 μL 200 mg/mL 的Con A（終質量濃度為5 mg/L），剩余孔作為空白組。置于37 ℃培養箱3 d，于培養結束前4 h取出，吸取100 μL上清液，每孔加入20 μL 5 mg/mL經過濾除菌的MTT溶液，繼續培養4 h。培養結束吸取液體，每孔加入120 μL 37 ℃預溫的DMSO液振蕩10 min，酶標儀作雙波長檢測，檢測波長570 nm，參考波長630 nm，按下式計算脾淋巴細胞增殖能力。

式中：A處理為Con A孔平均吸光度；A對照為空白孔平均吸光度。

1.4.4.3 荷瘤小鼠血清中SOD、CAT活力及MDA含量的測定

血清SOD、CAT酶活力、MDA含量均采用試劑盒測定，具體操作按其說明書進行。

1.5 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 蟬花多糖的體外抗腫瘤活性

2.1.1 對HeLa細胞的抑制作用

MTT法檢測蟬花多糖對HeLa細胞及細胞293T的作用，結果見表1，蟬花多糖對體外HeLa細胞的增殖有一定的抑制作用，其抑制率最高可達61.0%，并呈現劑量依賴關系。同時蟬花多糖對正常細胞293T的增殖有一定的促進作用，而陽性藥物5-FU對HeLa細胞和293T細胞均有較強的殺傷作用。由結果推斷，蟬花多糖對細胞的抑制具有選擇性，有望作為一種高效、低毒的抗腫瘤制劑。

表 1 蟬花多糖對HeLa及293T細胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of CSP on the proliferation of HeLa and293T cells組別 劑量/（μg/mL） 對HeLa細胞增殖抑制率/% 對293T細胞增殖抑制率/%對照組 0 0 0給藥組400 12.14±1.61 －12.62±0.46 500 21.70±0.87 －18.48±1.42 600 37.19±3.24 －22.13±1.84 700 48.17±3.66 －24.86±2.68 800 61.03±2.59 －28.34±2.45 5-FU陽性藥物組 25 59.75±3.53 50.83±2.60

2.1.2 對HeLa細胞形態學影響

用不同質量濃度的蟬花多糖分別處理HeLa細胞48 h后，觀察細胞的形態變化。由圖1可知，對照組細胞排列緊密，胞漿豐富，體積較大，呈多邊形，多數細胞呈堆疊生長，有少量漂浮細胞；而給藥組隨著質量濃度增大，活細胞數量逐漸減少，細胞排列疏松，體積變小，呈長梭形，且有不規則突起，同時部分細胞脫離周圍細胞，變圓，胞膜褶皺，形態學上呈現細胞凋亡狀態，可見凋亡細胞及凋亡小體形成，顯示蟬花多糖對HeLa細胞增殖具有抑制作用，與表1實驗結果相一致。

2.2 蟬花多糖對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用

注： #.與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。下同。

由表2可知，CSP對小鼠S180實體瘤有一定的抑制作用，并呈現明顯劑量效應，CSP各劑量組與模型組抑瘤率比較差異顯著（P＜0.05），且高劑量組對小鼠S180抑瘤率達到42.9%。

2.3 CSP對荷瘤小鼠免疫功能的影響

2.3.1 對荷瘤小鼠免疫器官指數的影響

胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其指數大小直接反映機體免疫水平的高低［14］。由表3可知，造模后模型小鼠的肝臟、胸腺指數均降低，而脾臟指數明顯增加，表明移植瘤對機體免疫器官產生一定程度的損傷。陽性藥物組荷瘤小鼠對于模型組的脾臟指數、胸腺指數均顯著降低，意味著荷瘤小鼠免疫器官受到嚴重損傷；而CSP給藥組小鼠脾臟指數、胸腺指數均有不同程度增加，其中高劑量組胸腺指數升高極顯著（P＜0.01），同時多糖給藥組具有顯著保肝作用，呈現劑量依賴關系。以上結果表明，蟬花多糖能較好保護機體免疫器官，抑制免疫器官功能喪失和防止免疫器官萎縮。

注：##.與模型組比較差異極顯著（P＜0.01）。下同。

2.3.2 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

脾臟是機體主要的外周免疫器官，其淋巴細胞增殖能力直接反映機體的免疫功能。由圖2可知，同空白組相比，模型組小鼠脾淋巴細胞增殖能力明顯降低，表明移植瘤的生長導致機體免疫系統功能降低。而CSP給藥組均能極顯著提升脾淋巴細胞的增殖能力（P＜0.01），且優于5-FU陽性藥物組，其中高劑量組淋巴細胞增殖能力達到76%。

2.3.3 對荷瘤小鼠抗氧化能力的影響

自由基學說認為，不少致癌物必須在體內經過代謝活化形成自由基并攻擊DNA才能致癌［15-16］。由表4可知，CSP給藥組荷瘤小鼠血清中SOD、高劑量組CAT酶的活性均不同程度高于模型組，表明多糖能提高機體自身的抗氧化酶活性；同時，小鼠血清中MDA水平較模型組極顯著降低（P＜0.01）。以上結果表明，蟬花多糖能提高荷瘤小鼠抗氧化能力，顯著減少氧化產物MDA含量。蟬花多糖對S180腫瘤生長的抑制作用可能與其增強機體內抗氧化能力相關。

表 4 蟬花多糖對荷瘤小鼠血清CAT、SOD酶活性、MDA含量的影響（x±s，n=8）Table 4 Effect of CSP on SOD and CAT activities and MDA level inserumofmicebearing S180sarcoma （x±s，n= 8）組別 劑量/（mg/ （kg·d））CAT酶活力/ （U/mL）SOD酶活力/ （U/mL）MDA含量/ （mmol/mL）空白組 0.81±0.50 92.65±28.33 5.08±0.70模型組 1.72±1.28 76.69±14.50 7.54±1.07 5-FU陽性藥物組 20 2.68±1.24##54.68±17.93#7.78±1.16##CSP低劑量組 100 1.41±0.28##84.24±19.12 5.88±1.47##CSP高劑量組 200 1.87±0.61##83.76±14.34 5.17±1.85##

3 討 論

真菌多糖具有多種生物活性和保健功能，近年來已成為生命科學、醫藥和食品科學領域的研究重點。諸多研究發現，真菌多糖多具有較強的抗腫瘤活性，對許多腫瘤細胞均有良好的抑制作用。同時大多數學者認為，其抗腫瘤作用途徑并不直接殺滅腫瘤細胞，而是通過增強機體免疫功能及提高機體拮抗氧化應激損傷的能力［17］，間接地抑制腫瘤細胞生長［18-19］。

本實驗通過對野生蟬花多糖的提取，進一步對多糖的體內、外抗腫瘤活性進行了研究。體外實驗表明，CSP 在400～800 μg/mL質量濃度范圍內對HeLa細胞均有抑制作用，當質量濃度為800 μg/mL時，HeLa細胞抑制率達到61%，并呈現量效關系；體內以移植性荷瘤小鼠為模型，當以200 mg/（kg·d）灌胃時，能有效抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，抑瘤率達到42.9%，顯示出良好的抗腫瘤作用。

胸腺、脾臟均為機體重要的免疫器官，作為淋巴細胞分化和成熟的重要場所，其指數的大小一定程度上直接體現免疫水平的高低，反映機體免疫功能狀況［20-22］；同時機體內淋巴細胞數量的增加，轉化率的提高亦可促進淋巴因子的產生，是反映機體細胞免疫功能的重要指標。實驗中腫瘤模型組小鼠由于受到腫瘤細胞的誘導而導致胸腺細胞逐步凋亡、胸腺萎縮，經過多糖處理后，小鼠免疫器官指數顯著提高，激活和促進脾淋巴細胞的增殖分化進而增強細胞免疫功能，說明CSP抗腫瘤機制與其促進機體免疫系統的活性有關，對免疫系統有著一定程度的保護及修復作用。

自由基學說認為，腫瘤的發生發展與機體內自由基穩態的破壞有關，其穩態的維持主要靠抗氧化酶系功能的發揮［23］。機體抗氧化酶系活力的大小反映其對自由基的清除能力，而MDA含量的高低直接反映機體的氧化應激損傷程度。本實驗結果顯示，移植瘤小鼠隨著腫瘤的生長，體內抗氧化酶系活力降低、MDA含量升高；而給予蟬花多糖處理后，此種情況得到改善，說明蟬花多糖能夠激活或者促進抗氧化酶系的表達，降低機體受自由基損壞的程度。

綜上所述，野生蟬花多糖具有較強的抗腫瘤活性，其功能的發揮與提高免疫調節能力及抗氧化活性密切相關。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613038

中圖分類號：R931

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0209-05

收稿日期：2015-08-06

基金項目：2013年汕頭大學教改項目；2013年廣東省高等學校教學質量與教學改革工程本科類立項建設項目；高水平大學建設項目

作者簡介：謝飛（1990—），男，碩士研究生，主要從事活性物質研究與開發。E-mail：14fxie@stu.edu.cn

*通信作者：陳美珍（1956—），女，教授，本科，主要從事活性物質研究與開發。E-mail：chenmz@stu.edu.cn

Antitumor Activity and Mechanism of Action of Wild Cordyceps sobolifera Polysaccharide

XIE Fei， LI Wei， CHEN Meizhen*， YU Jie
（College of Science， Shantou University， Shantou 515063， China）

Abstract:Objective: The antitumor activity of polysaccharides from wild Cordyceps sobolifera （CSP） was investigated in vitro and in vivo.Methods: 3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide （MTT） assay was used to determine the anti-proliferative effect of CSP at different doses on HeLa cells.S180 sarcoma mouse model was established and used to detect the antitumor activity and the effect on the immune system of CSP.Results: CSP at concentrations of 400-800 μg/mL inhibited the growth of HeLa cells in vitro in a concentration-dependent manner， with a percentage inhibition of 61% at 800 μg/mL.In vivo， CSP at both high （200 mg/（kg·d）） and low （100 mg/（kg·d）） doses had antitumor effects， with a percentage inhibition of 42.9% at 200 mg/（kg·d）， and immune organ indices of tumor-burdened mice signifcantly increased （P ＜ 0.01）.CSP also activated the proliferation and differentiation of lymphocytes， and had an obvious protection on the antioxidant defense system in the body.Conclusion: CSP has obvious antitumor activity in vitro and in vivo， which may be related to enhancing the immune system adjustment capacity and antioxidant activity.

Key words:Cordyceps sobolifera polysaccharide （CSP）； antitumor activity； immune regulation； antioxidant