長鏈非編碼RNA Linc00461干擾慢病毒的構建與鑒定

孫笑笑，王科，張彥

(1.無錫市第三人民醫院，江蘇 無錫　214041；2.重慶醫科大學附屬永川醫院，重慶　402160；3.重慶醫科大學，重慶　400016)

?

長鏈非編碼RNA Linc00461干擾慢病毒的構建與鑒定

孫笑笑1，王科2，張彥3

(1.無錫市第三人民醫院，江蘇 無錫214041；2.重慶醫科大學附屬永川醫院，重慶402160；3.重慶醫科大學，重慶400016)

摘要：目的制備shRNA干擾人長鏈非編碼RNA Linc00461的慢病毒載體(shRNA-Linc00461)，為進一步深入研究長鏈非編碼RNA的功能奠定基礎。方法利用在線干擾設計網頁進行干擾引物設計，根據小干擾RNA的設計原則，選取三對針對Linc00461特異性干擾引物送公司合成。合成的片段連接到慢病毒載體質粒pSIH1-H1，形成pSIH1-H1-shRNA-Linc00461質粒。用PCR及測序對其進行鑒定，之后與慢病毒包裝質粒混勻，由脂質體轉染至HEK293T細胞進行包裝，產生慢病毒shRNA-Linc00461，收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231細胞，通過RT-PCR鑒定重組慢病毒干擾效果。并選取干擾效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231細胞，運用MTT和流式細胞術檢測細胞增殖和周期的改變。結果SIH1-H1-shRNA Linc00461質粒經PCR驗證和測序后，證實其構建成功。shRNA-Linc00461在HEK293T細胞中重組成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231，感染效率約為70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231細胞后Linc00461的表達下調65.32%； 感染shRNA-Linc00461第3天MTT 結果顯示：實驗組吸光度值(0.232±0.032)明顯低于實驗對照組(0.398±0.037)。流式結果提示實驗組G2M 期細胞(47.55±5.063)%高于實驗對照組(8.876±3.565)%。結論成功構建了shRNA-Linc00461慢病毒載體，并能有效抑制Linc00461表達，為深入研究人Linc00461基因功能奠定了基礎。

關鍵詞：RNA,小分子干擾;乳腺腫瘤;慢病毒屬

在女性惡性腫瘤中，最常見的是乳腺癌，占第一位。其中中青年婦女乳腺癌的發病率呈逐年上升狀態[1]。乳腺癌是一個多基因多因素參與的復雜性疾病,病理機制極其復雜，乳腺癌的診斷目前主要是依據蛋白類腫瘤標志物的篩查和影像學檢查。一般乳腺癌病人發現的時候很多都是中晚期，臨床治療上有很大的難度，所以對于乳腺癌來說，做到早期發現早期治療顯得尤為重要。乳腺癌的發生往往是由遺傳因素和環境因素共同作用的，近年來，在遺傳研究方面,全基因組關聯研究(genome-wide association studies,GWAS)和基于候選基因的單核苷酸基因多態性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)關聯研究找到一些與乳腺癌相關的遺傳變異[2]。研究者發現表觀遺傳學在乳腺癌的發生和發展機制中發揮著極其重要的作用。

長鏈非編碼RNA lncRNA(long non-coding RNA) 是一類長度大于 200 nts且不編碼蛋白質的RNA分子。lncRNA能通過形成復雜的二級甚至更高級結構來發揮多種生物學功能。lncRNA在生物體中可通過與DNA、RNA或蛋白質結合，在轉錄、轉錄后或表觀遺傳學水平發揮一定的調節作用。近來研究發現，lncRNA作為一種表觀遺傳修飾類型，在腫瘤的發生和發展中起著重要作用[3]。最近報道LncRNA UCA1在膀胱癌組織中呈現表達上調，過表達UCA1可以促進BLS-211細胞的增殖、侵襲和遷移現象，王帆等人在卵巢癌SKOV3細胞中過表達UCA1能促進其侵襲、遷移而且這種現象與MMP2和MMP9的表達上調有關[4]。王銘輝課題組發現lncRNA HOTAIR在食管鱗狀細胞癌組織中的表達明顯升高，HOTAIR表達與食管鱗狀細胞癌的臨床分期、浸潤深度、有無淋巴結的轉移及其分化程度密切相關[5]。另有研究報道SChLAP1 能夠通過拮抗具有腫瘤抑制作用的 SWI/SNF 復合體來促進前列腺癌的浸潤和轉移，導致前列腺癌相關死亡率升高。lncRNAs-uc001lsz 的表達與胃癌的 TNM 分期具有較高的關聯性，可作為胃癌早期診斷的潛在生物學指標。

課題前期研究發現Linc00461在乳腺癌中呈現高表達狀態，那么Linc00461在乳腺癌中是否發揮著一定的作用呢？Linc00461的升高是否會影響著乳腺癌細胞的增殖和周期的改變呢？為此，課題通過靶向RNA干擾技術研究Linc00461在乳腺癌中的具體作用。

1　材料與方法

1.1材料pSIH1-H1質粒(美國SBI公司)；乳腺癌MDA-MB-231細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；STBL-3菌種、HEK293T細胞(重慶醫科大學附屬永川醫院分子醫學實驗室)；Trizol，脂質體轉染試劑盒，L15培養基(Life公司)；試驗中所用引物，普通PCR和DNA連接試劑盒(大連寶生物技術有限公司)；限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4連接酶(New England Biolab公司)；質粒小抽試劑盒和DNA純化試劑盒(Omega公司),逆轉錄試劑盒(Promega公司)。

1.2方法

1.2.1shRNA干擾LINC00461引物和陰性對照引物的獲得將人Linc00461的mRNA基因(GenBank序列號為NR_015436.1)mRNA區輸入至Life RNA在線設計干擾網頁中，按照小干擾RNA的設計原則，選取三對干擾引物作為實驗組，同時設計一對完全隨機引物作為陰性干擾對照組，將選取的干擾引物按照shRNA的構成原則，中間以TCAAGAG為頸環結構。兩端添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。合成的DNA分別命名為shRNA-Linc00461的和shRNA-Negtive。表1。

表1　 shRNA Linc00461干擾序列設計

1.2.2干擾質粒PCR驗證引物的設計Linc00461干擾質粒PCR驗證引物上游5’AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’;下游5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’，未插入干擾片段質粒擴增長度105 bp，插入干擾片段后質粒擴增長度為161 bp,Linc00461PCR 上游引物：5’-GCGTGGACTACTCTGATG-3’下游引物：5’-CACCCAAGTGCTTACTGTCT-3’擴增長度192 bp;GAPDH上游引物：5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’,下游引物：5’-TGAGGTCCACCACCCTGT -3’擴增長度122 bp。

1.2.3shRNA-LINC00461和shRNA-Negtive基因與載體pSIH1-H1的連接BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pSIH1-H1質粒，酶切產物經純化后與DNA連接試劑盒連接，shRNA-Linc00461基因連接產物命名為pSIH1-H1-shRNA-Linc00461，shRNA-Negtive基因連接產物命名為pSIH1-H1-shRNA-Negtive。

1.2.4pSIH1-H1-shRNA-LINC00461和pSIH1-H1-shRNA-Negtive質粒的鑒定以上連接產物經Cacl2化轉入STBL-3菌，接種于LB平板，37℃培養過夜后挑取單個菌落增菌培養12 h后提質粒，取5 μL菌落進行PCR鑒定， 取10 μL送南京金斯瑞有限公司進行測序。

1.2.5shRNA干擾慢病毒(shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive)的包裝將測序正確的干擾質粒和慢病毒包裝質粒按慢病毒包裝質粒試劑盒混勻，并將以上產物與Lipofectamine 2000轉染入HEK293T細胞，37℃，5%CO2培養，適時觀察熒光表達量， 48 h后離心，收集上清至無菌EP管備用。

1.2.6重組干擾慢病毒在MDA-MB-231中干擾效果的測定收集包含病毒顆粒的培養液加入到MDA-MB-231中，24 h后觀察慢病毒感染熒光的表達情況，并提取細胞總RNA。在RNA水平觀察干擾效果。

1.2.7慢病毒感染與熒光觀察MDA-MB-231細胞密度達到70%～80%時加入慢病毒干擾顆粒。設空白對照組(MDA-MB-231)、GFP感染組、陰性對照感染組、慢病毒干擾組。加病毒24h后觀察各組的熒光表達情況。

1.2.8逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)Trizol法提取各組細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板進行PCR。反應條件為:94℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共30個循環;最后72 ℃延伸5 min。行瓊脂糖凝膠電泳后成像結果用Qunantity One軟件進行分析,目的基因LncRNA相對表達量以目的基因條帶的灰度值/內參條帶灰度值表示。

1.2.9MTT 檢測細胞增殖將前期感染慢病毒細胞及各對照組細胞，以5×106個/L 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，每組設5 個平行孔，細胞培養1～5 d 后分別在酶聯免疫檢測儀上波長492 nm 處對各孔進行吸光度(D)值的檢測。

1.2.10流式檢測細胞周期的改變收集慢病毒感染MDA-MB-231 后3天的各組細胞， 經過消化，離心，洗滌，重懸后收集于1.5 mL EP 管中，上流式細胞儀檢測細胞周期。

2　結果

2.1shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive的鑒定經PCR初步驗證后在200 bp左右有條帶，認為連接成功(圖1)，送公司測序并將測序結果比對后，證明質粒完全構建成功，實驗流程以shRNA-Linc00461-1構建過程為例說明。

圖1　shRNA-Linc00461-1PCR檢測結果

2.2shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive慢病毒在MDA-MB-231細胞中的感染情況將收集于EP管內的病毒液(shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive慢病毒)加入直徑為6 cm細胞密度為60%～80%的MDA-MB-231培養皿中，24 h后觀察細胞的熒光表達情況，鏡下可見熒光表達量約為70%(圖2)。

圖2　 MDA-MB-231中加入shRNA-Linc0046-1、 shRNA-Negtive熒光表達情況(×100)

2.3shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive在RNA水平的表達慢病毒感染MDA-MB-231后，24 h提取細胞總RNA，通過RT-PCR檢測linc00461干擾慢病毒的干擾效果。慢病毒感染24 h后，感染效率均約70%。RT-PCR顯示shRNA-Linc00461-1、shRNA-Linc00461-2和shRNA-Linc00461-3組細胞Linc00461 RNA 的表達較shRNA-Negtive組均有所降低(圖2)，分別降低了52.17%、56.37%和65.32%，由此可見shRNA-Linc00461-3的干擾效果最好，故選取shRNA-Linc00461-3用于做后續實驗。RT-PCR結果提示：干擾慢病毒載體構建成功(圖3)。

注：1：shRNA-Negtive；2：shRNA-Linc00461-1；3：shRNA-Linc00461-2；4：shRNA-Linc00461-3。

圖3干擾慢病毒對Linc00461基因的沉默效果

2.4MDA-MB-231中干擾Linc00461的表達對細胞增殖和周期的影響慢病毒感染MDA-MB-231第3天，MTT 結果顯示：干擾組吸光度值(0.232±0.032)明顯低于實驗對照組(0.398±0.037)，第5天，干擾組吸光度值(0.378±0.042)明顯低于實驗對照組(0.631±0.047)(P<0.05)。慢病毒感染MDA-MB-231的第3天，細胞周期阻滯在G2M期，干擾組G2M 期細胞(47.55±5.063)%高于陰性對照組(8.876±3.565)%(P<0.05)。結果提示Linc00461參與了MDA-MB-231細胞的增殖及周期過程(圖4)。

注：(A)RT-PCR檢測shRNALinc00461的干擾效果，(B)干擾Linc00461對細胞增殖的影響，(C)干擾Linc00461對細胞周期的影響。

圖4 shRNALinc00461的干擾效果及干擾Linc00461后對MDA-MB-231增殖、周期的影響

3　討論

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤(全世界每年有大約50萬人死于乳腺癌)，是一個多基因多因素參與的復雜性疾病,病理機制極其復雜，越來越多的學者致力于乳腺癌發病機理的研究。近年來，研究者發現表觀遺傳學在乳腺癌的發生和發展中發揮著著重要作用[6-8]。

LncRNA作為一種重要表觀遺傳修飾類型，在許多腫瘤中存在異常的表達，是腫瘤發生的一類重要因素。目前，對LncRNA的研究尚處于起步階段，其可能的來源包括(1)蛋白質編碼基因的結構中斷；(2)染色質重組；(3)非編碼基因通過逆轉錄轉座子進行復制的產物；(4)非編碼 RNA 發生相鄰的串聯復制；(5)基因組中轉座因子的插入產生功能性非編碼 RNA[9-10]。研究發現含有端粒重復單元的 RNA 序列與乳腺癌細胞的無限增殖能力相關；BCAR4與乳腺癌內分泌治療雌激素抵抗相關；HOTAIR 的表達量可作為預測乳腺癌轉移及預后的有效指標；LOC554202可以通過啟動子甲基化影響下游基因而調控乳腺癌的轉移；抑制ARA的表達可以降低乳腺癌化療中阿霉素的耐藥耐藥率[11]。張霞等人通過lncRNAs 表達譜也找到一些與乳腺癌密切相關的長鏈非編碼RNA[12]，而且有學者研究發現長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1可通過上調乳腺癌基因ZNF703表達來促進乳腺癌增殖[13]。H19 高表達影響細胞周期進程，促進細胞增殖與轉移[14-15]，LSINCT5 高表達可增加乳腺癌細胞增殖能力[16]，而對于Linc00461，國內罕有報道，有學者認為它與抑郁癥相關，我們前期探索發現Linc00461在乳腺癌細胞中表達廣泛，Linc00461可能參與乳腺癌惡性轉化過程。隨后通過SBI公司第四代慢病毒包裝系統，利用干擾在線設計網頁，設計三對針對Linc00461的短發卡RNA，并成功包裝成干擾慢病毒。經RT-PCR發現三對短發卡RNA對Linc00461均有干擾效果，shRNA-Linc00461-1(52.17%)、shRNA-Linc00461-2(56.37%)和shRNA-S Linc00461-3(65.32%)，shRNA-Linc00461-3干擾效果最好。干擾慢病毒感染MDA-MB-231細胞后發現其增殖能力明顯減弱，細胞周期檢測顯示細胞G2M期增多，表現為G2M期阻滯，初步證實Linc00461在乳腺癌增殖中的作用。

Linc00461干擾慢病毒的成功構建為后續研究Linc00461功能做了良好的鋪墊，進而可深入研究Linc00461在乳腺癌中的作用機制，為乳腺癌的治療尋找新的靶點新的思路。

參考文獻

[1]Maruyama R，Suzuki H．Long noncoding RNA involvement in cancer[J]．BMB Rep，2012，45(11):604-611.

[2]Braconi C，Valeri N，Kogure T，et al．Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(2):786-791.

[3]Gutschner T，H?mmerle M，Eissmann M，et al．The noncoding RNA MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cells[J]．Cancer Res，2013，73(3):1180-1189.

[4]王帆,周戩平,謝小娟,等.LncRNA UCA1對卵巢癌細胞侵襲及遷移的影響及機制[J].現代腫瘤醫學,2015(1):1-4.

[5]連貴勇,王銘輝,姜明,等.長鏈非編碼RNA HOTAIR在食管鱗狀細胞癌中的表達及意義[J].嶺南現代臨床外科,2012(6):407-409.

[6]楊哲鋒,李娟,馬志元,等.血漿LncRNA-HEIH表達水平與肝癌發病風險的關聯分析[J].現代腫瘤醫學,2015(1):80-84.

[7]Zhang X,Yuan X,Shi H,et al.Exosomess in cancer:small particle,big player[J].J Hematol Oncol,2015,8:83.doi:10.1186/s13045-015-0181-x.

[8]Yuan JH,Yang F,Wang F,et al.A long noncoding RNA activated by TGF-β promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell,2014,25(5):666-681.

[9]Ponting CP,Oliver PL,Reik W.Evolution and functions of long non-coding RNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.

[10] Kapranov P,Cheng J,Dike S,et al.RNA maps reveal new RNA classes and a possible function for pervasive transcription[J].Science,2007,316(5830):1484-1488.

[11] 楊亭,陳宸,李志路,等.與乳腺癌相關的長鏈非編碼 RNA 的研究進展[J].醫藥前沿,2015,5(16):9-11.

[12] 張霞,宋志旺,朱蕾蕾,等.乳腺癌lncRNAs表達譜的檢測[J].同濟大學學報(醫學版),2015(6):31-35.

[13] Shi Y,Li J,Liu Y,et al.The long noncoding RNA SPRY4-IT1 increases the proliferation of human breast cancer cells by upregulating ZNF703 expression[J].Mol Cancer,2015,14:51.doi:10.1186/s12943-015-0318-0.

[14] Shore AN,Herschkowitz JI,Rosen JM.Noncoding RNAs involved in mammary gland development and tumorigenesis:there’s a long way to go[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2012,17(1):43-58.

[15] Matouk IJ,Raveh E,Abu-lail R,et al.Oncofetal H19 RNA promotes tumor metastasis[J].Biochim Biophys Acta,2014,1843(7):1414-1426.

[16] Silva JM,Boczek NJ,Berres MW,et al.LSINCT5 is over expressed in breast and ovarian cancer and affects cellular proliferation[J].RNA Biol,2011,8(3):496-505.

基金項目：國家自然科學基金(81172017)；重慶市教委課題(KJ1500202)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.021

(收稿日期：2016-04-20，修回日期：2016-05-09)

Construction and identification of recombinant lentivirus vector interferring the expression of long non coding RNA Linc00461

SUN Xiaoxiao1,WANG Ke2,ZHANG Yan3

(1.WuxiNo.3People’sHospital,Wuxi,Jiangsu214041,China;2.YongchuanAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;3.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Abstract:ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector interfering human Linc00461 gene for its further research.MethodsShort hairpin RNA(shRNA) targeting Linc00461 gene was designed and DNA template was synthesized and subcloned into the Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1.The recombinant plasmid pSIH1-H1-shRNA-Linc00461 was confirmed by PCR and gene sequencing.Then pSIH1-H1-Linc00461 and Lentiviral packaging plasmid was transfected into HEK293 cells for packaging by liposome.And supernatant culture medium was collected to infect MDA-MB-231 breast cancer cells.shRNA-Linc00461 was identified by RT-PCR.Breast cancer cells MDA-MB-231 were transfected with shRNA-Linc00461 and the cells proliferation and change cell cycle were detected by MTT and FCM.ResultsThe recombinant Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1-shRNA-Linc00461 was successfully constructed.The recombinant Lentivirus vector shRNA-Linc00461 could be packaged in HEK293T and infected MDA-MB-231 successfully.The expression of Linc00461 gene was reduced by 65.32% when the breast cancer MDA-MB-231 cells were infected by shRNA-Linc00461.MTT assay showed that cell proliferation capacity decreased from (0.5780±0.047)to(0.432±0.042) and blocked cell cycle in G2M Phase was(47.55±5.063)%,higher than(8.876±3.565)% in control group.ConclusionsThe recombinant Lentivirus vector interfering Linc00461 gene was successfully constructed and inhibited the expression of Linc00461,which laid foundation for further research of Linc00461.

Key words:RNA,Small Interfering;Breast Neoplasms;Lentivirus