Caspase-3在皮膚鱗狀細胞癌及光線性角化病中的表達

施 健張克進繆 旭林 樺劉宏斌楊 揚

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·論著·

Caspase-3在皮膚鱗狀細胞癌及光線性角化病中的表達

施 健1張克進2繆 旭1林 樺1劉宏斌3楊 揚1

目的： 檢測Caspase-3在皮膚鱗狀細胞癌及光線性角化病組織中的表達。方法： 應用免疫組化法檢測16例皮膚鱗狀細胞癌皮損、27例光線性角化病皮損及24例正常皮膚組織中Caspase-3蛋白的表達。結果： Caspase-3在皮膚鱗狀細胞癌、光線性角化病及正常皮膚組織的表達率分別為37.50%，51.85%，79.17%，其表達含量在皮膚鱗狀細胞癌、光線性角化病、正常皮膚組織逐漸增加。結論： Caspase-3蛋白表達下調可能參與皮膚鱗狀細胞癌及光線性角化病的發病過程。

Caspase-3； 皮膚鱗狀細胞癌； 光線性角化病

光線性角化病（AK）又稱日光性角化病，是因長期紫外線照射而發生的一種癌前期病變［1］。目前一種新的定義認為AK是一種皮膚原位癌，國外有報道指出未予治療的AK可發展為侵襲性皮膚鱗狀細胞癌（SCC），但演變過程的原因和機制尚不明確。有研究表明凋亡在腫瘤的發生、發展中扮演著重要的角色，Caspase-3是細胞凋亡通路中重要的執行者，其表達異常可引起細胞凋亡和增殖異常，進而導致腫瘤等多種疾病的發生［2］。但目前有關Caspase-3在皮膚SCC及AK發生發展中的報道較少見。筆者通過檢測Caspase-3蛋白在皮膚SCC及AK中的表達情況，為進一步探討凋亡蛋白Caspase-3在AK及皮膚SCC發病過程中所起的作用提供可能的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料 石蠟包埋組織標本來自南通市第一人民醫院皮膚科2005年1月至2013年12月經皮膚病理確診的患者。SCC 16例，年齡（75.13±8.22）歲，其中男7例，女9例；病程3個月～6年；皮損部位：頭面部14例，軀干1例，四肢1例。AK 27例，年齡（70.04± 11.43）歲，其中男9例，女18例；病程6個月～11年；皮損部位：頭面部25例，軀干1例，四肢1例。正常對照組織24塊取自2014年我科皮膚外科手術中修整遺棄后的正常組織，年齡（66.71±15.45）歲，其中男12例，女12例；取材部位：頭面部15例，軀干3例，四肢6例。三組在年齡、性別及部位之間均具有可比性（P＞0.05）。

1.2主要試劑 Caspase-3兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司，稀釋工作濃度為1∶80，Envision法檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3實驗方法 將標本于4%甲醛中固定，石蠟包埋，采用LAB VISION 2D全自動免疫組化染色儀、ELIVISION二步法進行免疫組化染色。操作要點如下：所需蠟塊切成厚度為4 μm的薄片，載玻片要防止脫片：經洗滌劑浸泡8～24 h，流水沖洗過夜，蒸餾水漂洗2次，浸泡于95%酒精中過夜，蒸餾水洗2次，將載玻片排列整齊烘干，經POLY-L防脫片處理。置于67℃烘箱當中烘片2 h，脫蠟脫水。PBS沖洗，抗原修復用檸檬酸鹽緩沖液，微波爐中火處理10 min，流水自然冷卻。處理完畢后放入自動免疫組化染色儀中，編程。每張切片加1滴3%的H2O2，室溫下孵育10 min，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加1滴一抗，在室溫條件下孵育1 h，PBS沖洗；除去PBS，每張切片加1滴聚合物增強劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗；除去PBS，每張切片加1滴抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30 min，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加一滴新鮮配制的DAB，室溫條件下顯色5 min，蒸餾水沖洗。此過程均在自動免疫組化染色儀當中按照事先編好的程序完成。從自動免疫組化染色儀中取出已染色完畢的切片，蘇木素復染，0.1%HCL分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。用已知陽性標本做陽性對照，用PBS代替一抗和二抗作為空白對照。

1.4結果判斷 組織學上按照Eneroth等對高分化和低分化鱗癌的形態學描述進行分類。Caspase-3陽性判斷標準以胞漿或胞核出現棕黃染色為陽性，顯微鏡下隨機檢測5個獨立高倍鏡視野，根據陽性細胞所占百分比進行，以平均每100個細胞中陽性細胞占觀察細胞的百分比計算陽性細胞率，再取平均值。Caspase-3陽性標準：陽性反應的強度分為-（≤10%），+（10%～30%），2+（30%～51%），3+（＞51%）。1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行卡方檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1Caspase-3陽性表達主要在細胞質及細胞核，其在皮膚SCC、AK及正常皮膚的表皮組織中表達含量逐漸增加（圖1、2、3及表1）。16例皮膚SCC組織中6例表達陽性，陽性率為37.50%，其中14例高分化皮膚SCC中6例表達陽性，2例低分化皮膚SCC均表達陰性。27例 AK組織中14例表達陽性，陽性率為51.85%。24例正常對照組中19例表達陽性，陽性率為79.17%。正常對照組Caspase-3的表達高于AK組及SCC組，三組間表達具有統計學差異（χ2=7.60，P＜0.05）。

圖1　皮膚鱗狀細胞癌皮損中Caspase-3的表達（SP，×100）

圖2　光線性角化病皮損中Caspase-3的表達（SP，×100）

圖3　正常皮膚組織中Caspase-3的表達（SP，×100）

表1　Caspase-3蛋白在SCC、AK及正常皮膚中的表達 例

2.2Caspase-3在皮膚SCC組織中的表達低于正常對照組（χ2=7.11，P＜0.01），在AK組織中的表達亦低于正常對照組（χ2=4.15，P＜0.05），Caspase-3在皮膚SCC組織中的表達與AK組相比，無統計學差異（χ2= 0.83，P＞0.05）。

2.3Caspase-3在皮膚SCC組織，尤其是異型細胞數量多的區域表達多呈陰性（10/16），在AK組織中表達仍以陰性（13/27）為主，少許中度陽性（6/27）及強陽性（5/27），而在正常對照組中，Caspase-3在表皮組織廣泛強陽性表達（11/24）。

3　討論

目前越來越多的學者認為AK是一種皮膚原位癌，其實一開始就是從表皮棘細胞開始的鱗狀細胞癌，其作為一個多步衍生腫瘤的早期階段，以生物學統一體為特征，進一步擴散成鱗狀細胞癌［3-5］。國外有報道指出未治療的AK可發展為SCC。雖然每年僅約0.25%～20%的AK病變發展為SCC，然而60% 的SCC來源于AK［6］。

凋亡是在生命進化過程中形成的保守的基本生命活動之一，它能清除機體損傷、衰老或多余的細胞，是維持機體發育和自身組織穩定的重要生命現象。細胞凋亡的改變可以引起腫瘤的發生、發展。在細胞凋亡的信號傳遞中，Caspase家族居于重要地位。現認為Caspase-3的激活是凋亡的最終通路［7］。Eckhart等［8］研究顯示，從Caspase-1～10，除Caspase-5外，其余 Caspases均在人類角質形成細胞中表達。Lippens等［9］研究發現正常表皮中表達的Caspase-3無活性，而腫瘤組織中表達的Caspase-3有活性，提示Caspase-3與腫瘤細胞的凋亡有關。本研究中正常表皮組織中可見Caspase-3蛋白的廣泛性高表達，陽性率達79.17%，明顯高于在AK組織表達陽性率（51.85%）及皮膚SCC組織表達陽性率（37.50%），且發現Caspase-3蛋白在皮膚SCC、AK及正常對照組織中的表達成逐漸增多的趨勢，三組間表達具有統計學差異（χ2=7.60，P＜0.05）。從正常組織到AK，最后到皮膚SCC，Caspase-3蛋白陽性表達率逐漸降低，提示Caspase-3作為促凋亡因子，其表達的下降，可能導致AK及皮膚SCC的發生。促凋亡因子的低表達，抑制了細胞的凋亡過程，促進了腫瘤細胞的增殖，此現象與通常的細胞凋亡理論相吻合。通常情況下，促凋亡因子的高表達可促進凋亡的發生，引起腫瘤細胞死亡，從而抑制腫瘤的發展。我們的研究結果與邢君、陶菲克等［10，11］的文獻報道一致。本研究中Caspase-3在皮膚SCC組織中的表達與AK組相比，無統計學差異（χ2=0.83，P＞0.05），考慮與本研究中低分化皮膚 SCC組織標本過少有關，從而推測Caspase-3表達含量可能與異型細胞數量有關，異型細胞數量越多，分化程度越低，其表達含量越少。

我們的實驗結果顯示Caspase-3蛋白表達與皮膚表皮腫瘤發生發展有關，惡性程度越高，其表達含量越低。對Caspase-3蛋白的檢測可能有助于早期發現表皮腫瘤，尤其是皮膚SCC及AK，我們期望找到針對Caspase-3的靶位點進行干預治療，進而逆轉或者延緩腫瘤過程。然而，由于實驗時間和條件的限制，我們尚未能找到相關的能夠阻斷該細胞調亡途徑的靶向治療藥物，期待以后的進一步深入研究。此外，本實驗僅采用免疫組化方法從蛋白水平研究Caspase-3在皮膚腫瘤中的表達，期待今后從DNA和RNA水平對其及相關因子進行更深入的研究。

［1］孫建方，高天文.皮膚組織病理學［M］.北京：人民衛生出版社，2013.185-186.

［2］Boland K，Flanagan L，Prehn JH.Paracrine control of tissue regeneration and cell proliferation by Caspase-3［J］.Cell Death Dis，2013，4：725.

［3］Heaphy MR Jr，Ackerman AB.The nature of solar keratosis：a critical review in historical perspective［J］.J Am Acad Dermatol，2000，43（1 Pt 1）：138-150.

［4］Ackerman AB，Mones JM.Solar（actinic）keratosis is a squamous cell carcinoma［J］.Br J Dermatol，2006，155（1）：9-22.

［4］Marks R.Who benefits from calling a solar keratosis a squamous cell carcinoma［J］.Br J Dermatol，2006，155（1）：23-26.

［6］Roewert-Huber J，Stockfleth E，Kerl H.Pathology and pathobiology of actinic（solar）keratosis-an update［J］.Br J Dermatol，2007，157：18-20.

［7］丁瑜潔，陳曉棟，顧黎雄.角化棘皮瘤和皮膚鱗狀細胞癌凋亡相關蛋白表達的研究［J］.中華皮膚科雜志，2012，45 （2）：91-94.

［8］Eckhart L，Ban J，Fischer H，et al.Caspase-14：analysis of gene structure and mRNA expression during keratinocyte differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，277 （3）：655-659.

［9］Lippens S，Kockx M，Knaapen M，et al.Epidermal differentiation does not involve the proapoptotic executioner caspases，but is associated with Caspase-14 induction and processing［J］.Cell Death Differ，2000，7（12）：1218-1224.

［10］邢君，張寶林.Livin在皮膚鱗狀細胞癌中的表達及其與FHIT、Caspase-3相關性的初步研究.腫瘤研究與臨床，2009，21（5）：311-316.

［11］陶菲克，涂亞庭.Livin和Caspase-3在皮膚基底細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌組織中的表達及相關性分析.中國皮膚性病學雜志，2009，23（2）：87-88.

（收稿：2016-01-08 修回：2016-02-29）

Expression of Caspase-3 in cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis

SHI Jian1，ZHANG Kejin2，MIAO Xu1，LIN Hua1，LIU Hongbin3，YANG Yang1.
1.Department of Dermatology，First People's Hospital of Nantong，Nantong 226001，Jiangsu，China；2.Department of Dermatology，People's Hospital of Liaocheng，Liaocheng 252000，Shandong，China；3.Department of Pathology，First People's Hospital of Nantong，Nantong 226001，Jiangsu，China Corresponding author：SHI Jian，E-mail：jsntmcsj@163.com

Objective：To detect the level of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis.Methods：The level of Caspase-3 in 16 lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，27 lesions of actinic keratosis and 24 normal skin was detected by immunohistochemistry method.Results：The positivity rate of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，actinic keratosis and normal skin tissues was 37.50%，51.85%and 79.17%respectively.The expression quantity of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，actinic keratosis and normal skin was increased gradually.Conclusion：The down-regulated expression of Caspase-3 may be involved in the pathogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis.

Caspase-3；cutaneous squamous cell carcinoma；actinic keratosis

施健，E-mail：jsntmcsj@163.com

南通市衛生局青年科研基金項目（編號：WQ 2014003）

1南通市第一人民醫院皮膚科，江蘇南通，226001

2山東省聊城市人民醫院皮膚科，山東聊城，252000

3南通市第一人民醫院病理科，江蘇南通，226001