彌漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因檢測(cè)

翟玉娟王建波肖華靜趙 麗邱 瑩

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·論著·

彌漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因檢測(cè)

翟玉娟1王建波2肖華靜1趙 麗1邱 瑩1

目的： 檢測(cè)彌漫性掌跖角化病一家系中的KRT9基因突變情況。方法： 提取該家系中3例患者和3名家系正常成員及100名健康對(duì)照的外周血DNA，采取PCR擴(kuò)增KRT9基因序列，ABI PRISM-3700測(cè)序儀檢測(cè)KRT9基因突變情況。結(jié)果： 該家系中3例患者存在KRT9基因上第487位C＞T突變，而該家系的正常成員及健康對(duì)照未檢測(cè)到突變。結(jié)論： KRT9基因突變C487T可能與本家系彌漫性掌跖角化病發(fā)病有關(guān)。

彌漫性掌跖角化病； 白癜風(fēng)； 甲亢； 角蛋白9基因

彌漫性掌跖角化病是一種以手掌和足跖表皮角化過度為特征的難治性皮膚病，是掌跖角化病（palmoplantar keratoderm，PPK）中最常見的類型，為常染色體顯性遺傳。其又分為彌漫性表皮松解型掌跖角化病（diffuse epidermolytic PPK，DEPPK）和彌漫性非表皮松解型掌跖角化病（diffuse non-epidemaolytic PPK，DNEPPK），前者較為常見。DEPPK主要表現(xiàn)為手掌和足跖彌漫性角層增厚，病變部位周邊有明顯的紅斑邊緣，部分病例可伴有指關(guān)節(jié)墊［1，2］。

隨著遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，針對(duì)DEPPK致病基因的研究已取得很大進(jìn)展。1992年，Reis等采用遺傳連鎖分析方法首次將德國一DEPPK家系的突變基因定位于17q12-q21，而后通過基因測(cè)序的方法證實(shí)DEPPK的致病基因即為位于該區(qū)域的KRT9基因［3，4］。隨后，國內(nèi)外學(xué)者開展一系列不同DEPPK家系的KRT9基因檢測(cè)工作。迄今，已在不同DEPPK家系的KRT9基因中檢測(cè)到20余種不同的突變（www.Interfile.org），其中R163W最為常見［5］。目前報(bào)道的中國人DEPPK家系KRT9基因突變有以下幾種：N160S、R162Q、L167S、L159F、497delAinsGGCT、N160H和R163W［6］。

1　先證者資料

患者，男，29歲。掌跖角化過度29年，面部、四肢白斑4年，發(fā)現(xiàn)甲亢2年。患者出生后3個(gè)月掌跖部開始出現(xiàn)彌漫性角化，隨著年齡增加掌跖彌漫性角化過度明顯加重，局部色澤淡黃，表面光滑，多處皮損脫屑、皸裂。4年前手掌開始出現(xiàn)散在色素脫失斑，隨后半年內(nèi)色素脫失斑先后累及足背、雙下肢和面部。2年前患者因雙下肢乏力查血 FT3：17.79 pmol/L （3.80～6.00 pmol/L），F(xiàn)T4：47.27 pmol/L（7.90～14.40 pmol/L），TSH：0.020 uIU/mL（0.340～5.600 uIU/ mL），被診斷為甲狀腺功能亢進(jìn)癥（hyperthyroidism，簡稱甲亢）。體格檢查：一般情況好，各系統(tǒng)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常。皮膚科檢查：掌跖可見彌漫性淡黃色角化增厚組織，界清，表面干燥、質(zhì)硬，有少量脫屑和皸裂，角化性皮損邊緣有明顯紅斑（圖1a、b）。面部、雙手、雙下肢徑前和雙足背可見散在色素脫失斑，呈乳白色，大小不一，形狀多樣；雙手掌彌漫性色素脫失，并蔓延至雙手腕部（圖2a、b）。診斷：（1）彌漫性掌跖角化病；（2）白癜風(fēng)；（3）甲狀腺功能亢進(jìn)癥。

圖1　a：雙手掌彌漫性淡黃色角化增厚組織并色素脫失；b：雙足掌彌漫性淡黃色角化增厚組織 圖2 a：雙手背彌漫性乳白色色素脫失斑；b：雙足背散在乳白色色素脫失斑

2　家系調(diào)查

父母非近親結(jié)婚，家族四代共有彌漫性掌跖角化病13例，男6例，女7例，發(fā)病時(shí)間均為出生后3個(gè)月左右，皮損均表現(xiàn)為掌跖彌漫性角化過度。目前未發(fā)病者其子代均正常，發(fā)病無性別差異，無隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳（圖3）。另外，所有家族成員中除先證者外，無患白癜風(fēng)或甲亢者。

3　家系角蛋白9基因檢測(cè)

3.1實(shí)驗(yàn)方法 在簽署書面知情同意書后，對(duì)先證者（III 4）和其家系中另外2例患者（III 2、IV 2）和3例未患病成員（II 9、III 5、III 12）進(jìn)行血樣采集，每例抽取外周血3 mL。應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit（德國Qiagen公司）提取基因組DNA。另外，以同樣的方法提取100例無親緣關(guān)系的健康對(duì)照個(gè)體基因組DNA作為對(duì)照。通過美國國立圖書館網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查取角蛋白9（keratin 9，KRT9）基因mRNA序列，經(jīng)BLAST比對(duì)得到該基因的基因組序列（http：//www.Genome.UCSC.edu/），應(yīng)用Primer 3.0設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)KRT9基因8個(gè)外顯子進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接在 ABI PRISM-3700測(cè)序儀（Applied Biosystems）上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與人類基因組KRT9序列進(jìn)行比較，同時(shí)使用Phred-Phrap-Consed軟件包Versionl 2.0進(jìn)行分析。

3.2結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，3例患者KRT9基因的第487位堿基胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），使得KRT9基因的第1號(hào)外顯子163位密碼子由CGG突變成TGG，導(dǎo)致正常的精氨酸（Arginine，Arg）由色氨酸（Tryptophan，Trp）替代（圖4）。家系中3名正常人及100名無親緣關(guān)系的正常人均未見其改變，通過 Polyphen2.0（http：//genetics.bwh.harvard.edu/ pph2/）對(duì)突變蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得分為1.0，可能是致病的突變。

圖3　患者家系圖

圖4　先證者及家系中正常人KRT9基因第1外顯子部分測(cè)序結(jié)果

4　討論

本家系的突變位點(diǎn)即是 DEPPK中最常見的R163W突變，即487 C＞T突變使得KRT9基因的第1外顯子163位密碼子由CGG突變成TGG，導(dǎo)致正常的精氨酸被色氨酸替代。有研究表明，KRT9棒狀功能域的1Aa螺旋區(qū)的前15個(gè)氨基和2Ba螺旋區(qū)末端的10～11個(gè)氨基酸對(duì)角蛋白中間絲的聚集和穩(wěn)定至關(guān)重要［1］。163位是棒狀功能域1Aa螺旋區(qū)的第12位氨基酸，因此R163W突變將影響角蛋白中間絲的聚集，破壞中間絲網(wǎng)狀系統(tǒng)的形成，從而導(dǎo)致該病的發(fā)生。另外，有研究發(fā)現(xiàn)角蛋白1（Keratin l，KRT1）基因突變也可以引起DEPPK，目前證實(shí)的KRT1基因突變有4種：I497T、L437P、S223L和F231L［7-9］。

先證者從臨床特征看為DEPPK，而且本家系的突變位點(diǎn)也是DEPPK中最常見的R163W突變（新版本的角蛋白9序列發(fā)表于 2005年4月23日［gi：55956898］，突變R162W更換為R163W）。但先證者同時(shí)伴發(fā)白癜風(fēng)和甲亢實(shí)屬罕見。通過文獻(xiàn)檢索后確定，目前為止本病例三病共發(fā)于一個(gè)體現(xiàn)象應(yīng)為首次報(bào)道。2004年馮蘭珍等［10］曾報(bào)道殘毀性掌跖角化病伴白癜風(fēng)一例，其白癜風(fēng)皮損在患者腹部，不與掌跖角化皮損重合，此與本病例不同。掌跖角化病患者皮損過度角化，出現(xiàn)嚴(yán)重脫屑或皸裂，皮損中炎性細(xì)胞浸潤較多時(shí)有可能損傷到黑素細(xì)胞，導(dǎo)致黑素細(xì)胞密度降低或脫失，從而導(dǎo)致繼發(fā)性白癜風(fēng)。但臨床上掌跖角化病合并白癜風(fēng)的患者確為少數(shù)，兩者并發(fā)也很可能是隨機(jī)事件。然而，白癜風(fēng)合并甲亢已多有報(bào)道。目前研究認(rèn)為，白癜風(fēng)和甲亢均為與遺傳相關(guān)的自身免疫性疾病，并有學(xué)者通過調(diào)查認(rèn)為白癜風(fēng)和甲亢患者中兩者并發(fā)率高達(dá)25%［11］；在國內(nèi)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)兩者并發(fā)率為8.2%［12］。最新研究證實(shí)，白癜風(fēng)和自身免疫性甲狀腺病存在相關(guān)致病基因，即NLRP1基因［13］。故有學(xué)者提出對(duì)白癜風(fēng)患者應(yīng)該常規(guī)篩查甲狀腺疾病［14］。

總之，先證者為三病并發(fā)的特殊病例，KRT9基因R163W突變是此DEPPK家系的明確致病因素，先證者DEPPK與白癜風(fēng)發(fā)病可能存在繼發(fā)或加重影響因素，與甲亢則可能為相互獨(dú)立事件，而白癜風(fēng)與甲亢相互伴發(fā)的現(xiàn)象提示臨床工作中應(yīng)重視和建立兩病相互伴發(fā)的篩查意識(shí)。

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（收稿：2016-02-01 修回：2016-02-16）

Mutations of keratin 9 gene in one family with diffuse plamoplantar keratoderma

ZHAI Yujuan1，WANG Jianbo2，XIAO HuaJing1，ZHAO Li1，QIU Ying1.
1.Department of Dermatology，Jining No.1 People's Hospital，Jining 272000，Shandong，China；2.Department of Dermatology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，China
Correspondence author：QIU Ying，E-mail：qiuyingjn@163.com

Objective：To identify mutations of keratin 9 gene（KRT9）in a family with diffuse plamoplantar keratoderma（DPPK）.Methods：DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in a family （3 patients and 3 normal members）and 100 healthy controls.All the exons of KRT9 were amplified by PCR and direct DNA sequencing was performed by ABI PRISM-3700 sequenator.Results：A missense mutation （487C＞T）in the KRT9 gene was identified in the three patients and none of mutation was found in 3 normal family members and healthy controls.Conclusion：The mutation of C487T in KRT9 gene is associated with the onset of diffuse palmoplantar keratoderma in the family.

diffuse plamoplantar keratoderma；vitiligo；hyperthyroidism；KRT9 gene

邱瑩，E-mail：qiuyingjn@163.com

1濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧，272000

2河南省人民醫(yī)院皮膚科，河南鄭州，450003