細胞自噬及相關因子在老年肝外傷中的表達及意義

滕旭　許赤　孟煒　李曉華

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細胞自噬及相關因子在老年肝外傷中的表達及意義

滕旭許赤孟煒李曉華

目的研究細胞自噬及相關因子在老年肝外傷中的表達，探討在老年肝臟缺血再灌注損傷中誘導老年肝細胞自噬的分子機制。方法選取不同鼠齡的大鼠，建立老年大鼠肝外傷缺血再灌注損傷的模型，通過采用電子顯微鏡、免疫印跡和熒光顯微鏡等方法觀察細胞自噬與細胞凋亡，研究因子Bcl-2及Beclin 1在細胞自噬/細胞凋亡之間的調控關系。結果Beclin 1在老年大鼠肝外傷再灌注期表達明顯增多，而Bcl-2的表達下調(P<0.01), Bcl-2和Beclin 1平衡狀態失調，免疫印跡表明Beclin 1陽性細胞百分率(40.8±10.6)%與Bcl-2(17.6±5.2)%比較差異有統計學意義(P<0.01),而在中晚期階段(外傷后3～6月)，Bcl-2表達下調的作用減緩，同時也激活Beclin 1激活自噬，此時年輕大鼠與老年大鼠的肝功能檢測及病理切片檢查差異不大(P>0.01)。結論Bcl-2與Beclin 1在老年肝臟缺血再灌注損傷的分子機制中可能發揮著重要作用。

老年肝臟；缺血再灌注損傷；細胞因子調節

細胞自噬直接參與器官損傷術后缺血再灌注損傷。長期臨床和實驗研究發現，老年大鼠肝臟外傷后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調,可以激活Beclin 1誘導細胞自噬。但是Bcl-2及Beclin 1在老年大鼠肝外傷術后不同時期的誘導細胞自噬/細胞凋亡，發揮細胞保護/細胞損傷作用的調控機制尚不清楚。本研究建立老年大鼠肝外傷缺血再灌注損傷的模型，通過電子顯微鏡、免疫印跡和熒光顯微鏡等方法，觀察細胞自噬與細胞凋亡，研究Bcl-2及Beclin 1與細胞自噬/細胞凋亡之間的調控關系，探討在老年肝臟的缺血再灌注損傷中誘導老年肝細胞自噬的分子機制。以期為老年肝外傷的合理治療提供依據，同時探討嚴格的治療年齡標準，以保證手術質量，提高老年肝外傷的手術療效。

資料和方法

一、試驗材料

選取不同年齡的大鼠來進行比較。根據大鼠鼠齡分組：(1)青年組：鼠齡6月；(2)鼠齡17月組；(3)鼠齡20月組；(4)鼠齡23月組；(5)鼠齡26月組。每組分為2個亞組，其中一組，術前2 d至術后3 d雷帕霉素灌胃[0.2 mg/(kg·d)]。選擇成年大鼠，體型匹配，鼠齡均為6月作為對照，每組30例。每例大鼠肝修整時，取3×1×1 mm3大小的肝組織2～3份，置于冷藏的 2.5%戊二醛前固定，備電子顯微鏡檢查；切取肝組織10%甲醛固定，備病理學檢查。其中6例分別于術后1、3、7 d斷尾取血1 mL，測血清ALT和GGT；分別于術后1、3、7 d處死2只，分別于術后3月和6月處死6只，快速取肝組織2～3份，置于冷藏的2.5%戊二醛前固定，備電子顯微鏡檢查。取肝組織10%甲醛固定，備病理學檢查。

二、實驗方法

①電子顯微鏡觀察：預固定標本，2 h后更換磷酸鹽緩沖液，1%鋨酸固定2 h，丙酮脫水，618環氧樹脂包埋，60℃固化，按電鏡觀察要求制成0.2 μm厚的超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重片染，日立H-600型透射電鏡下觀察。

②取新鮮大鼠肝組織，用0.25%的EDTA-膠原酶分離原代肝細胞。制成細胞懸液，吸干后加入1×測定/裂解緩沖液[50 mM乙磺酸(Hepes)(pH 7.4), 140 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM乙二醇雙四乙酸(EGTA), 0.4% NP-40, 10 mM焦磷酸, 5 mM釩酸內Na3VO4, 1 μg/mL亮抑酶肽，1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)]，反復冰凍，獲得細胞裂解液，將細胞裂解產物移至離心管中，14,000×g，4℃離心10 min，收集上清至離心管中，做western blot檢測，以每孔20 μL上樣，電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉后，分別加入LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Bcl-2、Beclin 1等Rabbit mAb，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后二抗孵育，ECL底片顯影分析。

③免疫組織染色：根據術后不同時間點，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉大鼠，活體心臟灌注10 mL生理鹽水，將循環血沖洗干凈。通過心臟再灌注10 mL 4%多聚甲醛進行固定，然后再灌注10 mL生理鹽水，肝組織置于4%多聚甲醛中固定24 h后，放入20%蔗糖溶液中脫水過夜，將標本保存于-80℃。送往病理科作病理切片，切成5 μm的切片，保存于-20℃，進行免疫熒光組織染色。

三、統計學分析

結　　果

一、老年肝細胞缺血再灌注的超微病理結構變化

透視電鏡掃描表明，缺血再灌注早期老年肝細胞核膜上絨毛樣突起增多，胞漿內有大量空泡，粗面內質網增多。(見圖1)

圖1　透視電鏡掃描老年肝細胞缺血再灌注超微病理結構

二、熒光定量PCR檢測Bcl-2、Beclin 1等細胞自噬過程中所產生相關因子的表達水平變化

結果顯示，老年肝細胞缺血再灌注的Beclin 1陽性細胞百分率(40.8±10.6)%與Bcl-2(17.6±5.2)%比較差異有統計學意義(P<0.01),而在中晚期階段(外傷后3～6月)，Bcl-2表達下調的作用減緩，同時也激活Beclin 1來激活自噬，此時Bcl-2與Beclin 1的表達基本達到平衡狀態(P>0.01)(見表1)。

三、Western印跡檢測Bcl-2與Beclin 1的表達

結果顯示，老年大鼠肝外傷后缺血再灌注期肝細胞中Beclin 1的表達較強，蛋白表達條帶清晰可見，而Bcl-2則表達較少，兩者差異有統計學意義(P<0.01)(見圖2)。

圖2　Western bloting檢測Bcl-2、Beclin 1蛋白表達情況

四、老年大鼠肝外傷的肝功能檢測

包括ALT、AST、TBil、rGT、TP、每周2～3次，結果顯示老年大鼠肝外傷后TBil、ALT等在不同時期的肝功能比較，與對照組(青年大鼠組)差異無統計學意義(表2)。

表1　大鼠肝細胞自噬過程中Bcl-2與Beclin 1在不同時期的變化比較(n=30，±s)

表2　試驗大鼠肝外傷后不同時期的肝功能指標情況(±s)

討　　論

臨床發現年齡僅為影響因素之一，與老年關系較為密切的是營養不良所致的貧血、免疫功能降低、組織結構退化等增加多臟器功能障礙的危險[1,2]，而術后缺血再灌注損傷是影響老年肝臟外傷術后療效的關鍵，健康的老年患者術后仍然有較好的肝功能，可獲得滿意療效[3,4]。相比心、肺、腎等其他臟器,老年肝臟顯示“功能特惠” 現象，而目前國內外研究較少，結論也不一致。我們面臨的主要問題是老年肝臟的缺血再灌注損傷是否可像年輕肝臟一樣恢復功能？手術后是否可長期生存？其機制是什么？

研究表明，Bcl-2和Beclin 1相互作用影響自噬的功能，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，對自噬也起一定作用[5]。課題組通過對長期臨床數據的整理、回顧研究發現老年肝臟損傷術后5～7 d，肝功能恢復延遲，而中長期肝功能恢復與年輕肝臟相比，差異不大。盡管研究表明老年肝臟的功能隨年齡增加而降低的趨勢，但是鼠齡低于23月的老年大鼠(相當于人類75歲)在肝外傷術后仍然可恢復功能[6]。研究發現，在老年肝臟的缺血/再灌注中，Bcl-2表達下調增加，誘發凋亡增加，雖然通過激活Beclin 1來激活自噬，此時凋亡作用大于自噬保護作用，導致肝功能恢復延遲。在中長期恢復階段，Bcl-2表達下調的作用減緩，同時也激活Beclin 1來激活自噬，此時自噬保護作用大于凋亡作用，導致肝功能恢復與年輕肝臟相比，差異不大。但在老年肝臟中Bcl-2和Beclin 1的之間相互作用如何調控細胞自噬及細胞凋亡信號通路？在老年肝外傷術后缺血/再灌注對肝臟功能恢復有何影響？均是亟須回答的科學問題。通過細胞自噬/細胞凋亡調節機制的研究，探索老年肝外傷術后，肝臟生存期延長的可能機制，同時可望尋找到反映肝臟的缺血/再灌注損傷的可靠指標；一方面臨床需要為老年肝外傷的治療提供更為嚴格的年齡上限標準；另一方面，探討具有“功能特惠”特點的老年肝臟外傷后恢復機能的生理機制，以期縮短康復時間，減輕患者費用負擔，具有巨大的社會效益。

細胞自噬最早1962年在電子顯微鏡下被觀察到，在生理情況下其在清除無用的、多余的、受損的或癌變的細胞器,維持機體內環境穩態方面發揮重要作用，在病理情況下也起了重要的作用[7-10]。有研究表明自噬和肝臟缺血/再灌注關系密切。而關于細胞自噬在肝臟缺血再灌注損傷中的作用爭議不一：發揮細胞保護作用[11]？還是促進細胞死亡[12, 13]？有大量文獻報道，自噬在慢性肝臟缺血中發揮細胞保護作用，仍有研究表明自噬可促進細胞死亡[14]。Matsui等[15]研究表明，在缺血階段自噬起的是保護作用,而在再灌注階段自噬卻是有害的。目前的研究表明，急慢性肝臟缺血可以誘導自噬, 而再灌注可以進一步強化自噬體的形成; 但過于嚴重和時間太長的缺血卻可以抑制自噬;更重要的是,如果自噬不適當的激活可能會加速細胞死亡。

對細胞自噬過程的研究發現，Bcl-2和Beclin 1的相互作用可能在器官外傷后的缺血再灌注損傷發揮重要的作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，對自噬也起一定作用[16-17]。研究發現，Beclin 1在再灌注時表達明顯增多,Bcl-2和Beclin 1的平衡狀態失調,此時凋亡作用大于自噬保護作用,結果是促進了細胞死亡。

肝臟具有很強的新陳代謝能力,能夠產生大量的自由基[18-19]。Bcl-2是研究最早的凋亡相關基因, 其家族蛋白在此通路中起到關鍵性的調控作用[20]。Bcl-2對各種刺激誘導的凋亡有阻抑效應，在衰老細胞里，Bcl-2表達降低[19-23]。臨床研究也發現，老年全肝血流阻斷下肝外傷術后3～5 d，肝功能恢復延遲，而中長期肝功能恢復與年輕肝臟相比，差異不大。本研究從細胞凋亡信號通路以及細胞自噬調控的角度，研究Bcl-2和Beclin 1對老年肝外傷術后缺血/再灌注損傷的保護作用及分子機制，以期對老年肝外傷年齡上限的治療選擇及合理治療提供理論指導作用。

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(本文編輯：易玲)

2016-02-20)

518117廣東廣東省深圳市龍崗區第六人民醫院普外科(滕旭)；中山大學附屬三院肝外科(許赤，孟煒，李曉華)