人外周血基因組DNA提取的影響因素及方案選擇

張 振，楊文濤，陳 炯，馮 巍

·綜述·

人外周血基因組DNA提取的影響因素及方案選擇

張 振1，楊文濤2，陳 炯1，馮 巍1

目的 人外周血是基因組DNA樣品的主要來源之一，了解外周血基因組DNA提取的研究進展，有助于法醫檢案中選擇并優化DNA提取方案。方法 回顧外周血基因組DNA提取的主要環節和影響因素，綜述文獻進行比較研究。結果 白細胞裂解是決定DNA提取產量和質量的關鍵環節，去污劑是各種白細胞裂解液的核心組分。裂解后DNA分離純化是影響DNA提取的另一重要環節，目前固相介質分離純化法應用較廣。實驗室手工方案在一般實驗室處理小批量樣品時仍具有獨特優勢，試劑盒方案目前應用較為廣泛，自動化提取系統尤其適用于大批量樣品處理。然而，任何方案均不能同時滿足DNA產量與質量、操作時間、安全性、費用等指標的同時最優化的要求。結論 人外周血基因組DNA提取方案眾多，需綜合考慮DNA提取效能、操作時間、安全性、費用、設備和試劑易得性等多種因素，選擇適宜的DNA提取方案。

外周血；基因組DNA；DNA提取

從臨床診斷到生物醫學基礎研究，外周血樣品(以下簡稱“血樣”)一直是最常用的生物檢材之一[1]，能否從中提取高產量、高質量基因組脫氧核糖核酸(genomic deoxyribonucleic acid，gDNA)是限制后續DNA分子操作的關鍵環節。血樣gDNA提取方案眾多，其機制不一，簡繁各異，耗費不等，安危有別，因而迄今尚無公認的普適性方案[2-4]。因此，有必要把握血樣gDNA提取的主要環節及其操作原理，并了解各種方案的提取效果，才能針對自身實驗目的和實際條件，選擇并優化方案。本研究綜述相關提取方案，以期為選擇并優化實驗方案提供參考。

1 血樣基因組DNA提取的主要環節及影響因素

一般而言，血樣gDNA提取包含如下操作環節：白細胞分離，白細胞裂解，DNA分離純化。現有血樣gDNA提取方法，均源自于上述操作的增刪或者改良，見圖1。

1.1 白細胞分離

人類外周血中，每微升僅包含有核白細胞約4 000～10 000個，血清、紅細胞、血小板等其他組分中包含大量蛋白質、脂類、多糖、無機鹽及小分子物質，可不同程度地抑制擴增酶、限制性內切酶、連接酶等多種生物酶活性[5]。因而，白細胞成分洗滌分離，成為許多血樣gDNA提取方案的起始步驟。

對于新鮮或冷藏抗凝血樣，靜置或離心后，富集的白細胞層可直接轉移至新管，加入等滲的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)或生理鹽水，反復洗滌，即可獲得較為純凈的白細胞成分。這種白細胞直接分離操作，通常用于較多量的血樣(5 mL以上)。實際上低滲液洗滌法更為常用，該法又稱為全血裂解法。利用細胞滲透脆性差異，血樣中加入低滲洗滌液而后離心，可除去非白細胞成分。有多種低滲洗滌液可供選擇，最簡單的就是去離子水[6]，應用最為廣泛的則是紅細胞裂解液(20 mmol·L-1Tris-Cl,pH7.6)，還有文獻在10 mmol·L-1Tris-Cl(pH7.5～8.0)緩沖液的基礎上，添加蔗糖、MgCl2、Triton X100、KCl、EDTA 、NP-40、NH4Cl等[7-10]。 凍融過程對血細胞膜結構破壞顯著，因此，通常使用等滲PBS洗滌凍藏抗凝血[11]。也有文獻報道，-20 ℃保存15～30 a的凍藏血樣，使用低滲TE緩沖液洗滌，也可以有效分離白細胞成分[9]。

實際工作中，具體選擇哪種或哪幾種白細胞分離方法，其操作原則：既要盡可能徹底去除紅細胞、血清等無核成分，同時要盡可能保護白細胞結構穩定性，以免DNA過多損失。

1.2 白細胞裂解

血樣gDNA提取方案眾多，甚至依據DNA分離純化措施予以命名及分類，但是方案的核心環節均是白細胞裂解，這是決定DNA提取產量及質量的最關鍵步驟。

1.2.1 固相裂解 將外周血涂布于醫用紗布、棉簽、濾紙或FTA卡等固相載體上，干燥脫水，即可裂解血細胞并抑制核酸酶活性。在干燥、避光的室溫環境中，干燥血樣可長期保存[1]。

1.2.2 液相裂解 純水就是一種最簡單的細胞裂解液，而經典的細胞裂解液幾乎都包含蛋白酶、去污劑和鹽類。

1.2.2.1 去污劑 去污劑是細胞裂解液的核心組分，是由疏水基團和親水基團構成的有機化合物。在特定的溫度、濃度條件下，去污劑分子在水溶液中形成膠束，后者的疏水中心會結合到蛋白質、脂質的疏水區域，破壞蛋白質—蛋白質、蛋白質—脂質、脂質—脂質之間的非共價連接[12]，從而使DNA游離于裂解體系中。去污劑可分為離子型、兩性離子型和非離子型3類，常見的十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate, SDS)、Triton家族、Tween家族、CHAPS、NP-40等[12]。最常應用的去污劑是SDS，其優點主要包括：①SDS活性強，幾乎可以破壞所有脂質、蛋白質的非共價鍵，從而使細胞膜結構破裂、蛋白質變性[12]。②SDS可增強蛋白酶K消化效果[13]。③各種類型的蛋白質與SDS結合后，都帶有相同密度的負電荷，且復合物呈短軸相同的長橢圓棒狀[14]，同時，SDS在溫度較低時會發生沉淀[15]，因而易于鹽析、離心去除。④SDS可溶于70%乙醇溶液，而DNA則溶解度極低，有助于進一步純化DNA樣品。

1.2.2.2 蛋白酶K 蛋白酶K(protease K, PK)是一種廣譜、高效的絲氨酸蛋白酶，能夠快速消化膜蛋白、組蛋白等結構蛋白，促進DNA游離；能夠快速滅活核酸酶，有助于保護游離DNA結構完整性[13,16-17]。與去污劑、尿素、EDTA等共存時，由于底物蛋白質變性、肽鏈伸展疏松，可極大促進PK消化活性[13]。在寬泛的pH范圍內(pH4.0～12.5)，PK均可保持穩定的生物活性[13,16,18]。因此，PK是很多細胞裂解方案的優選要素，尤其適用于超高分子量gDNA提取。

1.2.2.3 鹽類 細胞裂解液中鹽類的作用，主要有調節酸堿度(Tris-Cl)、抑制內源性核酸酶(EDTA)、穩定核酸結構(Tris-Cl、NaCl)、促進去污劑膠束形成(NaCl)等。經典的細胞裂解液一般包含PK、SDS、Tris-Cl 、EDTA 、NaCl等。要提取高分子量的、較純凈的gDNA，通常首選含蛋白酶K和去污劑的細胞裂解液，這也是多數商品化試劑盒的優選方案[19-20]。PK消化通常是DNA提取的限速環節，為了縮短操作時間，也可以不用PK，使用含Tris飽和酚[9]、鹽酸胍[21]、SDS[8,10,22-23]或洗衣粉[7]的細胞裂解液，甚至直接加熱溫育[24]，也能實現白細胞裂解并游離DNA的目的。此外，根據鹽離子濃度，細胞裂解液也可分為中鹽[7,9,11,23]、高鹽[8-10,25-26]緩沖液。

一般而言，白細胞裂解液的使用原則是：確保破壞白細胞結構，充分游離并保護DNA，且應保持DNA濃度適中，以便于后續DNA分離純化。然而，各種白細胞裂解液的組分及比例差異顯著，血樣與裂解液的體積比、孵育溫度及時間等因素也各不相同。同時，白細胞裂解液組成還受到上游白細胞分離、下游DNA分離純化環節的多因素影響。因此，如何根據實驗目的優化白細胞裂解液配方及操作條件，依然是一個有待深入研究的重要問題。

1.3 DNA分離純化 如何盡可能去除蛋白質、脂類、多糖及其他小分子物質，同時保證DNA產量及結構完整性，是DNA分離純化階段的核心問題。此外，DNA提取方法尚無公認的命名及分類標準，大多依據DNA分離純化措施予以確定。

1.3.1 有機試劑法

1.3.1.1 酚—氯仿 酚—氯仿抽提是最經典的DNA分離純化方法[1]。這種方法能夠充分除去蛋白質、脂質、色素等混雜物質[9]，得到高純度DNA[27]，且不需要特殊設備。但是，苯酚具有強烈腐蝕性，而氯仿具有肝毒性和致癌性，因此，可以使用特殊離心管進行酚—氯仿抽提DNA，利用硅質凝膠(silica gel polymer)封閉下層有機相，以避免有機試劑危害[28]。此外，使用低毒性苯甲醇(benzyl alcohol)，替代苯酚、氯仿，也能有效分離gDNA[29]。

1.3.1.2 甲酰胺 甲酰胺(formamide)是一種離子化有機溶劑，能解離蛋白質-DNA復合物，并使蛋白質變性游離。在細胞裂解混合物中，加入1.25倍體積的高濃度甲酰胺變性緩沖液，而后反復透析操作，即可得到長達7 200 kb的gDNA。但是，這種方法操作時間長，DNA損失嚴重[21]。

1.3.2 鹽析法 利用溶解度差異分離蛋白質與DNA，即是鹽析法分離純化DNA的理論基礎。鹽析通常使用終濃度1.2～1.8 mol·L-1的NaCl[8, 25, 30]或者0.75 mol·L-1的KAc[23]。鹽析法幾乎避免了有機試劑法的所有缺點，操作簡便，因而可用于批量血樣處理。缺點則是DNA純度(蛋白質殘留)不夠穩定，但通常A260/A280也能達到1.8左右[2]。

1.3.3 固體介質法 固體介質種類繁多，一般基于分子篩效應(size exclusion chromatography，SEC)、離子交換(ion-exchange chromatography，IEC)或親和作用(affinity chromatography，AC)，實現核酸的分離純化[1]。與純液相操作方法相比，利用固體介質分離純化DNA，受人為因素干擾小，操作穩定性高，且非常適用于大批量核酸提取，因而被絕大多數商品化試劑盒所采用[1,4,31]。不過，此類方法通常費用較高[2]。

1.3.3.1 硅質介質(silica matices) 在高離序鹽環境中(胍鹽、高氯酸鹽、碘鹽和醇等)，DNA 能被硅質介質特異性地吸附，經一系列快速漂洗操作，去除非特異性吸附的雜質，而后使用低鹽溶液或去離子水洗脫[31-33]。此類商品化試劑盒很多，如NucleoSpin?、UltraClean?、BloodSpin?、QIAamp?、Wizard?、EconoSpin?、GenElute?等，通常40～60 min，即可得到較高純度的gDNA[31]。

1.3.3.2 離子交換樹脂(ion exchange resins) Chelex-100由苯乙烯、苯二乙烯共聚體構成，對多價金屬離子有強烈的螯合效應，從而抑制DNA降解，是法醫遺傳學提取血樣gDNA的最常用方法[34-35]。血樣經簡單洗滌后，加入Chelex-100，直接加熱孵育，DNA即可釋放、游離于上清液中。該法操作簡單快捷，可用于微量血樣處理，但所提取DNA樣品雜質較多，長期保存易于降解，且DNA呈單鏈形式的較短片段，通常僅用于PCR，而不適用于限制性酶切、克隆等分子操作[31,34-35]。二乙氨基乙基纖維素(diethylaminoethyl cellulose，DEAE-C)是一種弱堿性陰離子交換樹脂，在特定pH和鹽濃度下，可特異性結合DNA，而后快速漂洗，去除RNA、多糖等非特異性結合物，從而得到純凈的gDNA樣品[4,36]。

1.3.3.3 磁珠(magnetic beads) 利用磁珠法提取gDNA，通常采用硅質膜包被的生物磁珠。在Chaotropic鹽體系[33]或Kosmotropic鹽體系[37]中，硅質膜磁珠特異性吸附核酸，形成核酸—磁珠復合體。該復合體可通過磁場分離而無需離心，經快速洗滌和溶解，即可得到理想的DNA[38-39]。該方法可處理微量血樣(30 μL)，DNA產量高、質量好，尤其是不需離心，操作簡單、快速而高效，易于實現自動化，便于大批量血樣處理，因而也是當前試劑盒的重點研發方法[1,3,6,39-40]。

2 gDNA提取方案的比較

理想的DNA提取方案應滿足以下要求：DNA產量與質量滿足研究要求，結果穩定，樣品污染風險低，操作簡便，快速，安全，費用低廉，不需特殊設備等[22,31]。盡管血樣gDNA提取方案(包括試劑盒)多達數十種，但任何一種方案都很難同時滿足上述要求[31]。Lahiri等[22]采集5份EDTA抗凝血，比較研究了11種DNA提取方案，這些方案均為手工操作，不涉及試劑盒試劑或固體介質。結果Lahiri-A法產量最高，5 mL全血可得(210±28)μg的DNA；Promega法產量最低，僅(55±2)μg。11種方案的A260/A280比值為1.70～1.94之間，而是否使用苯酚、氯仿，對DNA純度影響不甚明顯。所得DNA片段長度均大于23 kb，僅Kunkel法出現相對明顯的DNA降解現象，全部DNA樣品均能滿足RE酶切、Southern blot。在操作時間方面，Lahiri-A法、Lahiri-B法僅需1 h，速度最快，見表1。

商品試劑盒使用固定的緩沖液和固體分離介質，極大改善了DNA提取效率和穩定性。Chacon-Cortes等[2]搜集了11份長期凍藏血樣(-80 ℃，8 a以上)，選擇了一種傳統鹽析提取、改良硅珠鹽析提取和試劑盒硅質膜純化柱，比較三者DNA產量、純度、每樣品費用和操作時間等，見表2。

表1 11種gDNA手工提取方案的比較

注：文獻來源：J Biochem Biophys Methods,1992,25(4):193-205。

表2 gDNA手工與試劑盒提取方案比較

注：O/N：過夜。文獻來源：Mol Biol Rep,2012,39(5):5961-5966。

Lee等[41]比較研究了3種自動化DNA提取系統，全血提取gDNA，并計算了每微升全血DNA校正產量。3種系統的操作時間、提取效率沒有顯著差異，都能得到高質量gDNA，見表3。

表3 3種自動化DNA提取系統比較

注：結果為每μL血樣的DNA產量。文獻來源：Yonsei Med J,2010,51(1):104-110。

3 血樣基因組DNA提取方案選擇

血樣gDNA提取方案可粗略劃分為3類：實驗室手工方案、半自動化試劑盒方案和全自動化提取系統。

3.1 實驗室手工方案 實驗室手工方案中，綜合考慮DNA產量與質量、安全性、操作時間、費用等因素，最優方案應該是“白細胞洗滌分離+SDS細胞裂解+NaCl鹽析+醇沉淀純化DNA”。該方案無需特殊場地和設備，試劑及耗材低廉，安全無毒害，操作簡單，所有步驟都能靈活調整，適用于一般實驗室小批量提取血樣gDNA。但是，此類方案的試劑配制步驟繁瑣，操作費時費力，結果不夠穩定。因此，尋求一種快速、簡單、廉價的手工提取方案，仍然具有重要的研究及應用價值。

3.2 試劑盒方案 試劑盒方案基本克服了傳統手工操作方案的缺點，尤其是硅質膜純化柱法、磁珠法，已經成為血樣gDNA提取的主流策略，廣泛應用于生命科學各領域。然而，樣品量過大時，超過固體介質吸附能力，可能導致DNA損失或雜質殘留，仍然是試劑盒方案的弱點。此外，特殊設備(如磁力架)和費用仍然遠大于手工方案。

3.3 自動化提取系統 試劑盒聯用自動化工作站系統，能完全擺脫手工操作，可最大限度地減少人為誤差的干擾，結果相對穩定，非常適用于臨床診斷、疾病控制中心等場所，進行大批量血樣處理。但是，需要特殊場地、設備，而且試劑及耗材昂貴。

綜上所述，白細胞裂解是決定DNA提取產量和質量的關鍵環節，去污劑是各種白細胞裂解液的核心組分。裂解后DNA分離純化是影響DNA提取的另一重要環節，目前固相介質分離純化法應用較廣。實驗室手工方案在一般實驗室處理小批量樣品時仍具有獨特優勢，試劑盒方案目前應用較為廣泛，自動化提取系統尤其適用于大批量樣品處理。因此，人外周血基因組DNA提取方案眾多，需綜合考慮DNA提取效能、操作時間、安全性、費用、設備和試劑易得性等多種因素，選擇適宜的DNA提取方案。

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Influential Factor and Protocols Selection for Genomic DNA Extraction from Human Peripheral Blood Samples

ZHANG Zhen1, YANG Wen-tao2, CHEN Jiong1, FENG Wei1

(1.School of Forensic Medicine, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Neixiang County Public Security Bureau,Neixiang 474350, China )

ObjectiveHuman peripheral blood samples were one of the main sources used to obtain genomic deoxyribonucleic acid (gDNA). In order to select the optimal DNA extraction protocol on forensic identification, it would be helpful to investigate the research progress of DNA extraction.MethodsThere reviewed the common procedures adopted by most DNA extraction protocols, and highlighted the principles of its operation and impact factors by searching the representative studies from database.ResultsThe lysis of white blood cell (WBC) was a key step to determine the yield and quality of extracted DNA. Detergents were usually the core component of a variety of WBC lysis solution. Another key step was the separation and purification of free DNA which usually involved some solid media. The manual protocols had still common alternatives for DNA extraction from peripheral blood samples, especially when a few samples were processed in small laboratories. A variety of DNA extraction kits had been widely used at present. Several automated systems for gDNA extraction were very suitable for treating the large quantities of blood samples. However, there was not enough scientific evidence to support one particular DNA extraction method from whole blood samples in terms of DNA yield and quality, time consumption, safety, and cost.ConclusionThe optimal choice for gDNA extraction had still based on comprehensive consideration of multiple items, such as DNA extraction efficiency, time consumption, safety, cost, and availability of equipment and reagents from variety protocols.

peripheral blood；genomic DNA；DNA extraction

1672-688X(2016)04-0310-06

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.022

國家自然科學基金(81501634) 河南科技大學高級別項目培育基金(012ZCX021)

2016-07-25

1.河南科技大學法醫學院，河南洛陽471003 2.內鄉縣公安局，河南內鄉474350

張振(1973-)，男，河南淮陽人，博士，講師，從事法醫遺傳學研究工作。

D919.2

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