GSK-3β蛋白在膠質瘤中的表達水平及臨床意義

張峰楊宏李慶堂殷英桃

GSK-3β蛋白在膠質瘤中的表達水平及臨床意義

張峰①楊宏②李慶堂①殷英桃③

目的：檢測正常腦組織和不同級別膠質瘤中GSK-3β的表達以及其意義。方法：收集41例膠質瘤和9例正常腦組織，利用免疫組織化學SP法檢測GSK-3β在組織中的表達，分析其表達在不同級別膠質瘤中的差異，進而明確其在膠質瘤進展中的作用。結果：GSK-3β在正常腦組織中呈高表達，為棕黃色細顆粒狀，主要表達定位于細胞質中，其在膠質瘤組織中呈低表達，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。進一步的分析發現，GSK-3β的表達水平隨著腫瘤級別的升高而逐步下降，WHO分級中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級間比較差異有統計學意義（P＜0.01）。但GSK-3β的表達水平與患者的性別和年齡無關（P＞0.05）。結論：GSK-3β的表達隨著膠質瘤惡性程度的增加而逐步下降，表明其在膠質瘤的發生發展中可能具有抑癌作用，GSK-3β有望成為治療膠質瘤的一個新靶點。

膠質瘤； GSK-3β； 免疫組織化學； 腦

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First-author’s address：The Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 511447，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.22.007

膠質瘤為顱內最常見的惡性腫瘤，亦稱神經膠質瘤。其是起源于神經間質細胞，發生于神經外胚層的腫瘤［1-3］。關于膠質瘤的發病機制目前研究的還不甚透徹，并且此類腫瘤的浸潤性生長非常明顯，導致腫瘤細胞與正常腦組織的邊界難以區分，通過手術難以切除干凈，因此外科治療效果不甚理想［3-4］。另外，通常的放化療副作用大，且難以有效抑制腫瘤，從而復發率高。目前的臨床數據表明，患者的5年生存率僅5%左右［5-6］。因此，了解膠質瘤的發病過程，對其發生發展的分子機制進行探討，將可為臨床治療提供新的思路。GSK-3（Glycogen synthase kinase-3，糖原合酶激酶-3）是表達廣泛的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β兩個異構體組成，且在進化上高度保守。目前對GSK-3β研究的最為廣泛深入，而關于GSK-3α的功能還知之甚少［7］。GSK-3β在所有組織中都有表達，而在腦組織中的表達幅度尤為富集。GSK-3β首先被發現的功能是可以抑制糖原的合成，而隨著研究的深入發現其作用相當廣泛，可對多種底物包括轉錄因子、結構蛋白、代謝和信號轉導相關蛋白等進行磷酸化，進而調控細胞的增殖、凋亡與遷移等，因而GSK-3β是一個重要的調節激酶［8］?，F有研究發現GSK-3β在腫瘤的發生發展中具有重要作用，但有關GSK-3β和膠質瘤的研究目前較少［9］。因此，本研究對正常腦組織和不同級別膠質瘤中GSK-3β的表達進行檢測，從而探討其在膠質瘤發病過程中的意義。

1　材料與方法

1.1材料 膠質瘤石蠟標本共41份，均來源于2010年4月-2013年3月本院神經外科進行手術切除的患者。術前均未行放、化療，且為第1次手術切除，并經病理證實，按WHO分級分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。同時選擇高血壓腦出血或顱腦損傷患者行內減壓手術時的腦組織標本9例作為對照組，石蠟標本由本院病理科負責切片提供，以4μm厚連續切片4張。

1.2HE染色 二甲苯脫蠟2次，10 min/次；濃度梯度酒精（100%-90%-80%-70%）作用2 min/次，蒸餾水洗2遍，1 min/次。加入蘇木素染液染色10 min，水洗1 min。加入分化液（1%鹽酸酒精）分化3 s，水洗。加入伊紅液浸染2 min，水洗后濃度梯度酒精（80%-90%-100%）分別脫水2、4、5 min。移入二甲苯Ⅰ中透明3～5 min，移入二甲苯Ⅱ中透明5～10 min，樹膠封固。

1.3免疫組化SP法 68 ℃烤片后，進行常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。加入3% H2O2于37 ℃孵育10 min，阻斷滅活內源性過氧化物酶，然后用PBS沖洗5 min，重復3次。加入0.01M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復，重復上述步驟PBS沖洗。加入正常羊血清工作液封閉，然后滴加GSK-3β一抗（CST公司）于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB/H2O2反應進行染色，自來水沖洗充分后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。以PBS液代替一抗作陰性對照，用已知陽性的乳腺癌組織作為陽性對照。

1.4GSK-3β表達分析 200倍顯微鏡下觀察，按隨機原則選取10個視野進行細胞計數，呈棕黃色染色的細胞為GSK-3β表達陽性細胞，總的陽性細胞個數記為n1，再計算總的膠質細胞個數記為n2，n1/n2即為標記指數（Label index，LI），取其平均值。對每例標本的GSK-3β表達標記指數進行計算，分析其表達與臨床病理的關系［10］。

1.5統計學處理 使用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間標記指數的比較采用兩組獨立樣本間的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1膠質瘤HE染色觀察 HE染色圖中可見腫瘤細胞大小不一，細胞質呈粉紅色，細胞核呈藍色，且核異型性明顯，核槳比例增大；隨著WHO級別的升高，瘤細胞的密度逐漸增大，有的可見瘤巨細胞，見圖1。

2.2GSK-3β在膠質瘤及正常腦組織中的表達差異 SP法免疫組化檢測結果顯示，GSK-3β主要表達于細胞質中，呈棕黃色致密細顆粒狀（圖2）。GSK-3β在正常腦組織中呈高表達，平均標記指數為58.43%，在膠質瘤組織中相對低表達，平均標記指數為20.84%，兩者比較差異有統計學意義（t=6.928，P＜0.01）。而在膠質瘤組織中，GSK-3β在Ⅰ級膠質瘤中仍然表達較高，Ⅱ級中中等表達，Ⅲ級中低表達，Ⅳ級中極低或無表達（圖2）。

圖1 膠質瘤HE染色結果（×200）

圖2 免疫組化SP法檢測GSK-3β的表達（×200）

2.3GSK-3β表達的臨床意義 共檢測41例膠質瘤標本，其中男21例，女20例，平均標記指數分別為22.0%和19.6%，兩者比較差異無統計學意義（t=0.503，P=0.618）。按年齡段進行統計分析，年齡2～66歲，中位年齡32歲，分為≤20歲、20～40歲、40～60歲和≥60歲4個年齡段，病例數分別為13、12、15和1例，平均標記指數分別為28.4%、18.0%、17.0%和15.5%，各年齡組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。按腫瘤類型劃分，其中星形細胞瘤11例，室管膜瘤9例，少支膠質細胞瘤9例，混合性膠質瘤7例，多形膠質母細胞瘤3例，髓母細胞瘤和胚胎發育不良性上皮瘤各1例，陽性細胞率分別為6.5%、15.0%、22.7%、39.9%、39.5%、0和42.9%，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）。按WHO分級劃分，Ⅰ級8例，Ⅱ級11例，Ⅲ級14例，Ⅳ級8例，平均標記指數分別為40.6%、26.8%、16.4%、0.8%，各組間比較差異有統計學意義（P=0.008、0.006、0.000）

3　討論

人們最初發現GSK-3β是一種磷酸化糖原合成酶，促使葡萄糖進行糖酵解代謝［11］。不過隨著研究的深入，目前發現GSK-3β作用相當廣泛，它能磷酸化多種底物，例如轉錄因子、代謝酶類等，進而調控細胞的生長、凋亡等。其在體內與多種生理病理活動相關，包括細胞增殖、細胞周期調控、凋亡、遷移、胚胎發育、血管生成和微管微絲的穩定等［12］。目前有關其在一些神經系統疾病，如老年癡呆癥、中風和精神病，以及糖尿病和炎癥中的治療研究表明，其有可能是比較有效的靶點之一［13］。

鑒于GSK-3β在腫瘤發生發展中的重要意義，其被認為是一個重要的治療靶點。不過目前關于其是具有抑癌作用還是促癌作用仍然沒有定論［14-16］，有關研究表明，GSK-3β具有腫瘤抑制作用。例如在皮膚癌和乳腺癌中，GSK-3β活化或表達上調能夠抑制細胞的惡性轉化和腫瘤發展，這是因為GSK-3β能通過Wnt/β-catenin信號通路而導致癌基因β-catenin磷酸化降解，并且在HIV-tat、血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF）和PKC抑制劑staurosporine引起的細胞凋亡中發揮作用［17］。不過同時有研究發現，GSK-3β在結腸癌、胰腺癌等表達上調，并且具有促腫瘤生長作用。其機制是，GSK-3β能磷酸化NF-κB信號通路的成員，進而促進NF-κB介導的基因表達，最終對細胞增殖具有促進作用［18］。目前相互矛盾的觀點表明，在不同的腫瘤微環境下，GSK-3β可能表現出不同的功能，在某些腫瘤中，GSK-3β具有抑腫瘤生長的作用；而在另一些腫瘤中，其具有促進腫瘤生長的功能。上述的研究結果提示，GSK-3β在人類腫瘤發生發展中的作用可能復雜多變，因此對于GSK-3β在不同腫瘤環境中的具體作用機制和信號通路調控的系統研究，將有助于腫瘤發生機制的正確認識，從而為惡性腫瘤的治療提供新的靶點和理論依據［19-20］。對于GSK-3β在正常腦組織和膠質瘤組織中的表達差異，本研究進行了全面系統的檢測分析。結果表明，GSK-3β在正常腦組織中呈高表達，而在膠質瘤組織中呈低表達，且GSK-3β的表達水平隨著腫瘤級別的升高而逐步下降。由上述結果可推測，GSK-3β在膠質瘤中可能具有抑制癌細胞增殖轉移的作用。Zhao等［21］研究表明，GSK-3β能通過mTOR/p70S6K1信號通路而抑制膠質瘤的發生發展，其非活化形式p-GSK-3β（Ser9）的表達在膠質瘤組織中表達上調。Gürsel等［22］從患者來源的膠質母細胞瘤中分離出具有干細胞特征的細胞進行研究也發現，下調GSK-3β第9位Serine的磷酸化水平后，細胞增殖能力下調，而凋亡增加；不過當GSK-3β表達增加時，細胞增殖和克隆形成能力下降，而細胞凋亡增強。因此，本研究的發現與目前的研究進展相一致。

綜上所述，GSK-3β在膠質瘤中表達下調，其活性增加有可能會抑制膠質瘤細胞的生長遷移，因此GSK-3β有可能成為膠質瘤治療的一個新靶點。

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Expression and Clinical Significance of GSK-3β in Glioma

ZHANG Feng，YANG Hong，LI Qing-tang，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（22）：028-031

Objective：To analysis the expression and significance of GSK-3β in normal brain and different grade glioma tissues.Method：41 gliomas and 9 normal brain tissues were collected， and immunohistochemistry SP method was used to detect GSK-3β expression. Then its expression in different grades of glioma was analyzed，and its role in the development of gliomas was investigated.Result：GSK-3β was highly expressed in normal brain tissue，which was mainly localized in the cytoplasm with brown granular，its expression was low in the glioma tissues， compared two groups，the difference was statistically significant（P＜0.01）. The expression level of GSK-3β gradually decreased while the WHO grade of glioma increasing，there were statistically significant differences in the comparison of WHO classification Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ（P＜0.01）.But its expression level was not related to the gender and age of the patients.Conclusion：With the increase of the malignant degree of gliomas，the expression of GSK-3β decreased gradually，which indicated that it may play a role in the occurrence and development of glioma， and GSK-3β is expected to be a new target for the treatment of glioma.36-42.

Glioma； GSK-3β； Immunohistochemistry； Brain

①廣州醫科大學附屬第四醫院 廣東 廣州 511447
②廣州醫科大學附屬第二醫院
③廣東三九腦科醫院

楊宏

（2016-01-22） （本文編輯：周亞杰）

（2016-05-23） （本文編輯：周亞杰）