壞死性凋亡和p38 MAPK通路的相互作用介導高糖引起的H9c2 心肌細胞損傷

梁偉杰，何潔儀，陳君，余盛龍，張穩柱，宋明才，陳景福，馮鑒強，廖新學

(1. 廣州市番禺區中心醫院心血管內科，2. 廣州市番禺區心血管疾病研究所，廣東 廣州　511400； 3. 中山大學附屬第一醫院黃埔院區心血管內科CCU，廣東 廣州　510700；4. 中山大學附屬第一醫院心血管內科，廣東 廣州　510080)

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壞死性凋亡和p38 MAPK通路的相互作用介導高糖引起的H9c2 心肌細胞損傷

梁偉杰1,2，何潔儀1,2，陳君1,2，余盛龍1,2，張穩柱1,2，宋明才1,2，陳景福3，馮鑒強4，廖新學4

(1. 廣州市番禺區中心醫院心血管內科，2. 廣州市番禺區心血管疾病研究所，廣東 廣州511400； 3. 中山大學附屬第一醫院黃埔院區心血管內科CCU，廣東 廣州510700；4. 中山大學附屬第一醫院心血管內科，廣東 廣州510080)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.021

目的研究壞死性凋亡(necroptosis，Nec)和p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的相互作用在高糖引起H9c2 心肌細胞損傷中的作用。方法應用細胞計數盒檢測心肌細胞存活率；雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相法檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平；羅丹明 123染色熒光顯微鏡照相法測定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)；蛋白質免疫印跡法測定RIP3蛋白(反映Nec的指標)和p38MAPK蛋白的表達水平。結果高糖(35 mmol·L-1葡萄糖，HG)作用H9c2心肌細胞24 h可引起明顯的細胞損傷，表現為細胞存活率降低，ROS生成及MMP丟失增多；應用100 μmol·L-1necrostatin-1(Nec-1，Nec特異性抑制劑)和HG共處理心肌細胞24 h或3 μmol·L-1SB203580(p38MAPK抑制劑)預處理心肌細胞60 min，再予HG作用24 h可減輕高糖引起的上述損傷。此外，HG作用心肌細胞1、3、6、9、12、24、36和48 h均能明顯增加RIP3蛋白的表達水平，其中24 h時表達水平增加最明顯。應用100 μmol·L-1Nec-1共處理或3 μmol·L-1SB203580預處理心肌細胞均能明顯地抑制HG對RIP3蛋白表達的上調作用。另一方面，應用100 μmol·L-1Nec-1共處理心肌細胞能阻斷HG對磷酸化(p)-p38MAPK表達的上調作用。結論Nec和p38 MAPK通路的相互作用介導高糖引起H9c2 心肌細胞損傷。

壞死性凋亡；p38絲裂原激活蛋白激酶；相互作用；高糖；心肌細胞；損傷

細胞死亡是生命的基本過程，不僅參與生物的發育和自穩平衡，在多種疾病的發生、發展過程中也發揮重要的作用。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病的重要并發癥之一，嚴重地危害著人類的健康與生命。在DCM發生過程中，心肌細胞死亡起關鍵性的啟動作用。Cai等[1]報道：在糖尿病患者和動物模型中都可觀察到心肌細胞死亡。細胞死亡可分為凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)、自噬(autophagy)和壞死性凋亡(necroptosis，Nec)[1-5]。Nec是Degterev等于2005年首次報道的一種細胞死亡方式，廣泛參與缺血性心腦血管疾病、肝腎臟器損害、腫瘤及炎癥反應等病理生理過程[3,6-8]。在啟動Nec過程中，受體相互作用蛋白(receptor interaction protein，RIP)發揮重要的作用。目前，RIP蛋白家族由RIP1～RIP7共7個成員組成，其中RIP1 和RIP3 是參與Nec的重要分子蛋白，兩者的活化并形成復合物是啟動Nec的關鍵。多項實驗證實，RIP3是調控Nec的特異性蛋白因子，過量表達的RIP3可導致Nec發生，沉默或下調RIP3的表達可不同程度地阻止細胞發生Nec[7,9-10]。有研究報道，在鏈脲霉素(streptozotocin)誘導的糖尿病大鼠，心肌纖維化、肥厚、炎癥的發生伴隨著RIP3的大量表達[11]，提示Nec可能參與高血糖引起的心肌損傷。另有報道指出：Nec與p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的關系非常密切，p38MAPK通路可介導Nec的發生[12-13]。但是，在DCM細胞模型中，Nec能否介導高糖(high glucose, HG)引起的心肌細胞損傷，Nec與p38MAPK之間的關系如何，目前尚未見報道。

為此，本研究通過HG損傷H9c2心肌細胞建立DCM細胞模型[14]，旨在探討：① Nec能否介導HG引起的心肌細胞損傷；② 在HG損傷心肌細胞過程中，Nec和p38MAPK通路之間是否存在相互作用關系。

1　材料與方法

1.1材料抗RIP3抗體、抗p-p38MAPK抗體和抗t-p38MAPK抗體購自Cell Signaling(USA)；特級胎牛血清購自Gibco BRL(USA)；DMEM培養基由Hyclone公司(USA)供應；羅丹明123(rhodamine 123, Rh 123)和雙氯熒光素( 2’，7’-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)、SB203580(p38MAPK通路抑制劑)、necrostatin-1(Nec-1，Nec特異性抑制劑)購自Sigma-Aldrich(USA)；SB203580和Nec-1按照產品說明采用二甲基亞砜(DMSO)溶解后、DMEM培養基稀釋至目標濃度使用；細胞計數試劑盒8(cell counter kit-8, CCK-8)由Dojindo Lab(Japan)提供；H9c2 心肌細胞取自中山大學實驗動物中心。

1.2細胞培養及實驗分組H9c2 心肌細胞來源于大鼠胚胎期的心臟組織，置于含5% CO2的37 ℃溫箱中，于含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。實驗分為6組：(A)對照(control)組：DMEM培養基(5.5 mmol·L-1葡萄糖)處理心肌細胞24 h；(B)高糖(high glucose, HG)組：35 mmol·L-1葡萄糖作用心肌細胞24 h；(C)Nec-1+HG組：100 μmol·L-1Nec-1和35 mmol·L-1葡萄糖共處理心肌細胞24 h；(D)SB203580+HG組：3 μmol·L-1SB203580作用心肌細胞60 min，撤去，PBS洗2次，然后35 mmol·L-1葡萄糖處理心肌細胞24 h；(E)Nec-1組：100 μmol·L-1Nec-1和DMEM培養基共處理心肌細胞24 h；(F) SB203580組：3 μmol·L-1SB203580作用心肌細胞60 min，撤去，PBS洗2次，然后DMEM處理心肌細胞24 h。

1.3CCK-8 測定心肌細胞存活率將H9c2 心肌細胞接種于96孔培養板中，當細胞生長至約80%培養孔面積時，按照分組采取不同的處理后，棄上清， PBS液洗3次，于每孔加入90 μL DMEM和10 μL CCK-8溶液，37 ℃溫箱中孵育2.5 h，酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(A)。取5孔A值的平均數，按以下的公式計算細胞存活率：細胞存活率/%=處理組A /對照組A×100%。實驗重復5次。

1.4DCFH-DA染色測定細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平將H9c2 心肌細胞接種于24孔培養板中，當細胞生長至約80%培養孔面積時，按照分組采取不同處理后，PBS液洗3次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA染液，37℃溫箱中孵育30 min，然后用PBS液洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區攝片，用ImageJ 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值[平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，能間接反映ROS水平，數值越大，表示ROS水平越高]，并進行數據統計分析。實驗重復5次。

1.5Rh 123染色測定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)將H9c2 心肌細胞接種于24孔培養板中，當細胞生長至約80%培養孔面積時，按照分組采取不同處理后，PBS液洗3次，加入10 μg·L-1Rh 123染液，37 ℃溫箱中孵育45 min，然后PBS液洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh 123的線粒體。Image J 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光的MFI(其數值大小可反映MMP水平高低)，并進行數據統計分析。實驗重復5次。

1.6蛋白質免疫印跡法檢測RIP3和p38MAPK蛋白的表達水平將H9c2 心肌細胞接種于60 mm培養皿中，培養至約80%滿時，按照實驗分組采取不同的處理后，去上清液，PBS液洗滌后加入細胞裂解液，4 ℃搖床中作用30 min，14 000×g高速離心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸法進行蛋白定量。總蛋白經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到二氟化樹脂膜上。5%脫脂奶粉常溫下封閉60 min，隨后分別加入抗RIP3、抗t-p38或抗p-p38 抗體(濃度為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用預冷的TBST洗3 次，每次5 min，然后與相應的二抗(濃度為1 ∶2 500)室溫下孵育1.5 h，再予TBST洗3次，每次5 min。用增強化學發光法使二氟化樹脂膜顯色，暗室中將顯色條帶曝光到醫用X線片上，凝膠成像系統掃描分析結果。實驗重復5次。

2　結果

2.1Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌細胞毒性Fig 1A顯示，35 mmol·L-1葡萄糖(高糖，HG)作用心肌細胞24 h可引起明顯的心肌細胞毒性，降低細胞存活率，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。分別應用75、100、200、400、600、800 μmol·L-1Nec-1與HG共處理心肌細胞24 h，均能使細胞存活率升高，與HG組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其中100 μmol·L-1Nec-1對細胞毒性的抑制作用最為明顯。單純采用75、100、200、400、600、800 μmol·L-1Nec-1和DMEM分別共處理心肌細胞24 h均不影響細胞存活率(Fig 1B)。根據上述結果，本研究采用Nec-1的作用濃度為100 μmol·L-1。

與Nec-1的作用相類似，在HG作用前，應用3 μmol·L-1SB203580預處理心肌細胞60 min，也可提高細胞存活率，與HG組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。3 μmol·L-1SB203580本身對心肌細胞存活率無明顯的影響(Fig 1C)。

Fig 1　Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced cytotoxicity in H9c2 cardiac cells (n=5)

1: Control; 2: Glucose 35 mmol·L-1; 3: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; 4: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; 5: Nec-1 100 μmol·L-1. 6: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.2Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌細胞ROS堆積Fig 2B顯示，采用HG作用H9c2 心肌細胞24 h可使胞內DCFH-DA的MFI升高至(31.4±1.37)%，與正常對照組[MFI值為(11.1±0.81)%，Fig 2A]相比，差異具有統計學意義(P<0.01)。然而，100 μmol·L-1Nec-1和HG共處理心肌細胞24 h，可使MFI降低至(15.7±1.07)%，與HG組比較，兩者差異具有統計學意義(P<0.01，Fig 2C)。單純100 μmol·L-1Nec-1和DMEM共處理心肌細胞24 h對心肌細胞ROS的生成無明顯的影響(P>0.05，Fig 2E)。

與Nec-1的作用相類似，在HG作用前，應用3 μmol·L-1SB203580預處理心肌細胞60 min，可使MFI降低至(14.2±0.78)%，與HG組比較，差異具有統計學意義(P<0.01，Fig 2D)。3 μmol·L-1SB203580對心肌細胞ROS的生成無明顯的影響(P>0.05，Fig 2F)。

Fig 2　Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.3Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌細胞MMP丟失Fig 3顯示，采用HG作用H9c2 心肌細胞24 h可使胞內Rh 123的MFI從(31.5±1.20)%(正常對照組，Fig 3A)降低至(10.6±0.90)%(Fig 3B)，兩組差異具有統計學意義(P<0.01)。采用100 μmol·L-1Nec-1和HG共處理心肌細胞24 h，可使MFI升高至(21.8±1.14)%(Fig 3C)，與HG組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。單純Nec-1本身對心肌細胞MMP無明顯的影響(P>0.05，Fig 3E)。

與Nec-1的作用相類似，在HG作用前，應用3 μmol·L-1SB203580預處理心肌細胞60 min，可使心肌細胞內Rh 123的MFI升高至(20.5±1.20)%，與HG組比較，兩者差異具有統計學意義(P<0.01，Fig 3D)。SB203580本身對心肌細胞MMP無明顯的影響(P>0.05，Fig 3F)。

Fig 3　Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced mitochondrial membrane potential (MMP) loss in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.4HG促進心肌細胞RIP3蛋白的表達Fig 4顯示，HG分別作用H9c2心肌細胞1、3、6、9、12、24、36和48 h均能增加RIP3蛋白的表達，與正常對照組比較，差異均具有統計學意義(P均<0.01)，其中HG作用心肌24 h時，RIP3表達增加最明顯。

2.5Nec-1和SB203580減弱HG對心肌細胞RIP3蛋白表達的上調作用如前所述，HG可上調心肌細胞RIP3蛋白的表達；在HG作用前，應用100 μmol·L-1Nec-1和HG共處理心肌細胞24 h或應用3 μmol·L-1SB203580預處理60 min后，再予HG作用心肌細胞24 h，RIP3的表達水平明顯減少，與HG組對比，差異均具有統計學意義(P均<0.01)。100 μmol·L-1Nec-1或3 μmol·L-1SB203580本身對心肌細胞RIP3蛋白的基礎表達無明顯的影響(Fig 5)。

Fig 4　HG promotes expression of RIP3 protein in H9c2 cardiac cells (n=5)

H9c2 cardiac cells were exposed to HG for a 48 h period.**P<0.01vscontrol group.

Fig 5　Nec-1 and SB203580 attenuate HG-induced up-regulation of RIP3 expression in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.6Nec-1減輕HG對心肌細胞磷酸化p38MAPK表達的上調作用Fig 6顯示，應用HG處理心肌細胞24 h可使p-p38MAPK表達水平明顯增加，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。應用100 μmol·L-1Nec-1和HG共處理心肌細胞24 h，p-p38MAPK的表達水平明顯降低，與HG組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。100 μmol·L-1Nec-1本身對心肌細胞p-p38MAPK的基礎表達無明顯的影響。

Fig 6　Nec-1 attenuates HG-induced up-regulation of p-p38MAPK expression in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

3　討論

心肌細胞死亡在DCM的發生過程中發揮重要作用[1]。細胞的死亡方式包括apoptosis、necrosis、autophagy和Nec[1-5]。已有實驗證實：apoptosis、necrosis和autophagy參與DCM的發生和發展[2,3,15]。然而，Nec是否參與高血糖引起的心肌細胞損傷，目前尚未完全明了。最近，Liu等[11]觀察到，糖尿病大鼠在出現左心室重構及舒張功能障礙的同時，伴隨有RIP3表達明顯增加，提示Nec與糖尿病大鼠心肌損傷有關。但是，他們沒有應用抑制Nec的技術與方法進一步探討Nec在糖尿病心肌損傷中的作用。本實驗在觀察到HG引起心肌細胞損傷(包括細胞毒性、氧化應激和線粒體損傷)的同時，能明顯地上調心肌細胞RIP3蛋白的表達，采用Nec的特異性抑制劑Nec-1共處理心肌細胞不僅能減輕HG引起的心肌細胞損傷，使細胞存活率升高，ROS生成及MMP丟失減少，而且能明顯地抑制RIP3表達的上調。上述結果清晰地提示：Nec介導HG引起的心肌細胞毒性、氧化應激和線粒體受損等損傷，這從細胞學水平進一步深化了Liu等[11]的研究結果，為闡明Nec在糖尿病心肌損傷中的作用提供了新穎的實驗依據。

重要的是，我們進一步探討了Nec與p38MAPK通路的關系。p38MAPK通路是MAPK家族的重要成員之一，可被各種刺激(如炎癥、缺血缺氧、化學損傷等)激活，參與調控細胞生長、分化、凋亡等病理生理過程[16-17]。本研究和我們之前的研究[14，18]表明，Nec和p38MAPK通路可介導HG引起的H9c2 心肌細胞損傷，然而它們兩者之間的關系尚不清楚。在本實驗中，Nec的抑制劑Nec-1能明顯地抑制HG對p-p38MAPK表達的上調，提示Nec可通過激活p38MAPK通路引起心肌細胞損傷，這與之前其他細胞模型的研究結論相似[12-13]；另一方面，p38MAPK通路的抑制劑SB203580能對抗HG引起RIP3表達的上調，提示HG激活的p38MAPK通路可促進Nec的發生。因此，我們的研究證實：在HG損傷心肌細胞模型中，HG可激活p38 MAPK通路和誘導Nec發生，兩者之間存在正相互作用，Nec可激活p38MAPK通路，而激活的p38MAPK通路也可促進Nec的發生，兩者之間形成一個正反饋回路，在HG引起的心肌細胞毒性、氧化應激和線粒體損傷過程中發揮重要作用。

綜上所述，本實驗證實，Nec可介導HG誘導的H9c2 心肌細胞損傷，Nec與p38MAPK通路之間的正相互作用可能是HG引起心肌細胞損傷的重要機制之一。

(致謝：本實驗在中山大學中山醫學院科技樓開展，感謝馮鑒強教授和廖新學教授對本實驗設計、文稿書寫提出了很多寶貴的意見和建議。)

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Interaction between necroptosis and p38MAPK pathway mediates high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells

LIANG Wei-jie1,2, HE Jie-yi1,2, CHEN Jun1,2, YU Sheng-long1,2,ZHANG Wen-zhu1,2, SONG Ming-cai1,2,CHEN Jing-fu3, FENG Jian-qiang4, LIAO Xin-xue4

(1.DeptofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict，Guangzhou511400,China; 2.CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China; 3.CardiacCareUnitofDeptofCardiology,HuangpuDivisionoftheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China; 4.DeptofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

AimTo investigate the role of the interaction between necroptosis (Nec) and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway in the high glucose (HG)-induced H9c2 cardiac cells injury. MethodsThe cell viability was measured by cell counter kit-8 assay. The intracellular level of reactive oxygen species (ROS) was tested by DCFH-DA stating followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was detected by Rhodamine 123 staining followed by photofluorography. The expression levels of receptor interaction protein 3 (RIP3, an indicator of Nec) and p38MAPK protein were tested by Western blot assay. ResultsThe treatment of H9c2 cardiac cells with 35 mmol·L-1glucose (high glucose, HG) for 24 h induced considerable injuries, including a decrease in cell viability, increases in ROS generation as well as MMP loss. The co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1necrostatin-1(Nec-1，a specific inhibitor of Nec)and HG for 24 h or the pre-treatment of the cells with 3 μmol·L-1SB203580 (an inhibitor of p38MAPK) for 60 min before HG exposure attenuated the above injuries induced by HG. Moreover, the treatment of the cells with HG for 1,3,6,9,12,24,36 and 48 h significantly increased the expression levels of RIP3, peaking at 24 h. The co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1Nec-1 or the pre-treatment of the cells with 3 μmol·L-1SB203580 considerably blocked the up-regulation of RIP3 expression induced by HG. On the other hand, the co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1Nec-1 alleviated the HG-induced up-regulation of the expression of p-p38MAPK. ConclusionThe interaction between Nec and p38MAPK pathway mediates the HG-induced injury in H9c2 cardiac cells.

necroptosis; p38 mitogen-activated protein kinase; interaction; high glucose; cardiomyocyte; injury

2016-03-15，

2016-04-15

國家自然科學基金資助項目(No 81270296)；廣東省財政科技項目(No 2014SC107)

梁偉杰(1981-)，男，碩士，主治醫師，研究方向：心血管介入和心血管疾病的保護機制，Tel: 020-34859342，E-mail：279096515@qq.com；

廖新學(1965-)，男，博士，主任醫師，博士生導師，研究方向：心血管疾病的損傷與保護機制，通訊作者，Tel: 020-87332628，E-mail：liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

A

1001-1978(2016)08-1138-07

R322.11；R329.25；R341；R345.57；R587.1

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.042.html