泛素連接酶Cbl-b調控p38MAPK在胰島素與硒協同抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡中的作用

徐天嬌，劉　勇，李　萍，胥曉麗，曾菊絨

(1. 西安醫學院藥理學與毒理學教研室，陜西 西安　710021；2. 延安大學咸陽醫院老年病科，陜西 咸陽　712000)

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泛素連接酶Cbl-b調控p38MAPK在胰島素與硒協同抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡中的作用

徐天嬌1，劉勇2，李萍1，胥曉麗1，曾菊絨1

(1. 西安醫學院藥理學與毒理學教研室，陜西 西安710021；2. 延安大學咸陽醫院老年病科，陜西 咸陽712000)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.027

目的初步探討胰島素和硒協同抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡的機制。方法SD大鼠50只，隨機分為空白對照組(Control組)、糖尿病心肌病模型組(DCM組)、糖尿病心肌病+胰島素組(DCM+In組)、糖尿病心肌病+硒組(DCM+Se組)、糖尿病心肌病+胰島素+硒組(DCM+In+Se組)。TUNEL法觀察心肌細胞凋亡；Western blot觀察凋亡相關蛋白Bcl-2、caspase-3和PARP剪切片段的變化，同時觀察Cbl-b和p38MAPK表達變化；免疫沉淀法檢測Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax之間的相互作用。結果胰島素與硒協同抑制心肌細胞凋亡(P<0.01)；胰島素聯合硒協同，增加Cbl-b的表達，降低p38MAPK表達(P<0.01)；兩藥聯合協同增加Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax之間的相互作用(P<0.01)。結論胰島素與硒通過調控Cbl-b，抑制p38MAPK而阻止Bax轉位來協同抑制心肌細胞凋亡。

胰島素；硒；糖尿病心肌病；凋亡；Cbl-b；p38 絲裂原活化蛋白激酶；Ku70

高血糖及其誘導的氧化應激可通過激活p38MAPK促使Ku70釋放出與之結合的Bax，進而Bax從細胞質進入線粒體，同時激活凋亡程序中最后的執行者caspase-3，啟動細胞的線粒體凋亡途徑[1-2]。Cbl-b是糖尿病發生中的一個易感基因，文獻報道，糖尿病脂肪組織中Cbl-b與p38MAPK具有相互作用且能負性調控p38MAPK的表達；在Cbl-b+/+的3T3-L1脂肪細胞中給予胰島素刺激后，IRS-1磷酸化明顯增加，而Cbl-b-/-的3T3-L1脂肪細胞中IRS-1磷酸化未見明顯增加[3-4]，這些說明Cbl-b與糖尿病的發生發展有著密切的關系。因此，DCM心肌細胞中上調Cbl-b表達和下調p38MAPK表達對DCM大鼠心功能的恢復是十分重要的。

眾所周知，胰島素能夠快速有效的控制高血糖，但長期或大劑量使用會使療效降低并引起明顯的副作用(如胰島素抵抗、低血糖、脂肪萎縮等)。硒作為哺乳動物必需的微量元素之一，具有抗氧化和類胰島素樣作用，并能夠增強外周組織對胰島素的敏感性，但硒的安全攝入量范圍較窄，劑量過低降糖效果不明顯，甚至沒有降糖作用，過高又可導致慢性中毒癥狀。因此，將胰島素和硒聯合可以避免了大劑量單獨使用胰島素或硒所引起的不良反應。另外，與能夠增加c-Cbl的表達一樣，胰島素也能夠明顯提高Cbl-b的水平[5-6]。本研究旨在觀察胰島素聯合硒對DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響，同時檢測Cbl-b、p38MAPK、Bcl-2、PARP剪切片段、caspase-3的表達以及Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax之間的相互作用，初步探討胰島素與硒協同抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡的機制。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑鏈脲佐菌素(STZ)和亞硒酸鈉購于Sigma公司，中效胰島素由丹麥諾和靈公司生產；anti-Bcl-2、anti-Cbl-b、anti-p38MAPK、anti-Ku70和Protein A/G beads、β-actin等均購自美國Santa Cruz公司，anti-COX4抗購于美國Gene Tex公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備及分組選取體質量180～230 g的SD大鼠，♀♂各半，分籠飼養，適應性喂養1周。用STZ 55 mg·kg-1一次性腹腔注射，1周后取尾靜脈血測隨機血糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1，尿糖～作為入選標準。原飼料繼續喂養6周，經超聲檢測確定造模成功。

將大鼠隨機分為5組，每組10只。Control組：自由進水和飲食；DCM組：自由進水和飲食； DCM+In組：按1U·kg-1·d-1皮下注射胰島素；DCM+Se組：按180 μg·kg-1·d-1管飼亞硒酸鈉； DCM+In+Se組：按1U kg-1·d-1皮下注射胰島素，同時管飼180 μg kg-1·d-1亞硒酸鈉；每組均連續給藥6周。

1.2.2TUNEL檢測細胞凋亡心肌組織經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片。切片在二甲苯中脫蠟5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。滴加適量不含DNase的蛋白酶K，37℃作用20 min，PBS 洗滌3次。滴加TUNEL反應混合液于濕盒中，37℃反應1 h，PBS洗3次×3 min；擦去切片多余的液體，加適量DAB 溶液至切片上，室溫下放置5 min，除去DAB液體，蒸餾水洗3次。蘇木精復染，1%鹽酸酒精分化，蒸餾水返藍10 min。逐級乙醇脫水，透明，中性樹脂封片。在光鏡下觀察，以細胞核呈棕黃色為凋亡陽性細胞。在顯微鏡下(×400倍)計數凋亡細胞和總細胞數，并計數凋亡指數(apoptosis index，AI)/%=凋亡細胞/總細胞數×100%。

1.2.3Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、caspase-3、PARP剪切片段的表達以及心肌組織中Cbl-b和p38MAPK的表達將冷凍的心肌剪成碎塊，加入適量RIPA蛋白提取液勻漿器勻漿，冰浴上操作；提取蛋白，BCA測定蛋白濃度，確定每孔上樣蛋白量相等。取各組樣品50 μg蛋白質，進行SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白電轉移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h；加適當比例稀釋的一抗，4 ℃過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應，即刻用X光片曝光，目的條帶使用分析儀進行分析。

1.2.4免疫沉淀檢測Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax之間的相互作用取經提取的總蛋白300 μg加入1.5 mL預先放置了裂解液的離心管，加入5 μg的IP抗體， 4℃孵育2 h；加入30 μL Protein A/G beads，4℃翻轉1 h；4℃離心5 min，棄去上清液；Protein A/G beads用裂解液洗3～4次，每次1 mL，離心同上；加入15 μL 2×電泳上樣緩沖液，煮3～5 min。離心，取上清液；將上清液50 μg，進行SDS-PAGE分離蛋白。并將蛋白電轉移至PVDF膜上。再用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h；加適當稀釋的一抗后于4℃條件下孵育過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應，即刻用X光片曝光。

2　結果

2.1胰島素聯合硒協同抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡TUNEL法檢測凋亡心肌細胞核呈棕黃色染色，Control組大鼠心肌細胞核極少有棕黃染色(AI約為5%)；DCM組大鼠心肌細胞中出現大量棕黃染色(AI為 30%～40%)，與Control組差異存在顯著性(P<0.01)； DCM+In組(AI約為24%左右)、DCM+Se組(AI約為28%左右)和DCM+In+Se組(AI約為15%左右)心肌細胞棕黃色顆粒均明顯減少，與DCM組差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組心肌細胞中棕黃色染色明顯減少(P<0.01)(Fig 1)。

2.2胰島素聯合硒對凋亡相關蛋白Bcl-2、caspase-3、PARP剪切片段表達的影響Western blot結果顯示，與Control組比較，DCM組心肌細胞中Bcl-2表達明顯降低，caspase-3、PARP剪切片段表達明顯升高(P<0.01)；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組心肌細胞中Bcl-2明顯增加，同時caspase-3、PARP剪切片段明顯減少(P<0.01)；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組心肌細胞中Bcl-2表達明顯上升，同時caspase-3、PARP剪切片段表達明顯降低(P<0.01)(Fig 2)。以上結果說明，胰島素和硒能夠協同抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡。

Fig 1　TUNEL analysis of apoptosis in different groups(×400) A：Control；B：DCM；C：DCM+In；D：DCM+Se；E：DCM+In+Se

Fig 2　Levels of Bcl-2, caspase-3 and PARP in different groups

**P<0.01vscontrol；△P<0.05，△△P<0.01vsDCM；▲▲P<0.01vsDCM+In；##P<0.01vsDCM+Se

2.3胰島素聯合硒對DCM大鼠心肌組織中Cbl-b和p38MAPK表達的影響Western blot結果顯示，與Control組比較，DCM組Cbl-b表達明顯降低，而p38MAPK表達明顯升高(P<0.01)；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組心肌細胞中Cbl-b表達明顯增加，同時，p38MAPK表達明顯減少(P<0.01)；與DCM+In組和DCM+Se組比較，DCM+In+Se組心肌細胞中Cbl-b表達明顯上升，同時，p38MAPK表達明顯減少(P<0.01)(Fig 3)。以上結果說明，胰島素和硒能夠協同增加心肌組織中Cbl-b的表達，并且協同降低p38MAPK的表達。

Fig 3　Levels of Cbl-b and p38MAPK in different groups

**P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsDCM；▲▲P<0.01vsDCM+In；##P<0.01vsDCM+Se

2.4胰島素與硒對Cbl-b與p38MAPK之間相互作用的影響結果顯示，與Control組比較，DCM組Cbl-b與p38MAPK之間相互作用明顯減弱；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組心肌細胞中Cbl-b與p38MAPK之間相互作用明顯增強；與DCM+In組和DCM+ Se比較，DCM+In+Se組心肌細胞中Cbl-b與p38MAPK之間相互作用明顯增強(Fig 4)。

Fig 4　Cbl-b-p38MAPK interaction in control, DCM and DCM treated with insulin, selenium, combined dose of insulin and selenium

2.5胰島素與硒對Ku70與Bax之間相互作用的影響結果顯示，與Control組比較，DCM組Ku70與Bax之間相互作用明顯減弱；與DCM組比較，DCM+In組和DCM+In+Se組心肌細胞中Ku70與Bax之間相互作用明顯增強；與DCM+In組和DCM+ Se比較，DCM+In+Se組心肌細胞中Ku70與Bax之間相互作用明顯增強(Fig 5)。

Fig 5　Ku70-Bax interaction in different groups

3　討論

心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病變的一個重要特點，當心肌細胞凋亡達到一定數量時，就會導致心臟組織結構和心肌功能發生改變[8-9]。因此，早期使用能夠降低血糖同時改善氧化應激水平的藥物對于減少心肌細胞凋亡、改善心室重構及心功能不全具有十分重要的意義。

硒作為哺乳動物和人類必需的微量元素，具有抗氧化和類胰島素樣作用。并且我們前期研究已經證明：① 胰島素和硒具有聯合應用的切實可行性，并確定了胰島素和硒聯合的合理配比劑量(1 U·kg-1·d-1∶180 μg·kg-1·d-1)；② 胰島素和硒聯合應用在降低血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)以及血脂方面具有協同作用；③ 胰島素和硒聯合能夠明顯改善糖尿病心肌病大鼠心肌膠原網絡重構，并減少心肌膠原纖維堆積。基于上述原因，我們提出將胰島素和硒聯合用于DCM。

本實驗首先觀察胰島素和硒對DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響。結果顯示，胰島素與硒聯合明顯抑制心肌細胞凋亡，增加Bcl-2表達，減少PARP剪切片段和caspase-3表達；兩藥聯合應用在抑制細胞凋亡方面明顯優于單用胰島素或單用硒治療。

p38信號途徑是MAPK家族中的重要組成部分之一，在調節細胞凋亡、心肌肥厚等方面起重要作用。研究發現，在糖尿病心肌組織中，p38MAPK活性明顯增高，并且伴隨著心肌細胞凋亡增加[10-11]；p38MAPK能夠激活其下游的轉錄激活蛋白環磷腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)，而CREB的結合蛋白CBP具有內源性組蛋白乙酰基轉移酶活性，能夠直接引起組蛋白乙酰化(如Ku70乙酰化)[12]， Ku70被乙酰化后釋放出結合的Bax，促進Bax從細胞質進入線粒體轉位，啟動線粒體凋亡途徑。因此，下調p38MAPK對于抑制心肌細胞凋亡及心肌重塑具有十分重要的意義[13]。

泛素連接酶Cbl(casitas B-lineage lymphoma，Cbl)是一類分布廣泛、擁有E3泛素連接酶活性的胞內信號接頭蛋白，可以通過其不同的結構域與其它蛋白質分子結合，參與多種細胞信號轉導的過程。Cbl-b是Cbl家族主要成員之一，在多種細胞中其可通過負性調控p38MAPK影響細胞凋亡[14-15]。據此，進一步觀察胰島素與硒聯合對上述分子的影響有可能獲得更大的DCM防治益處。實驗結果表明，DCM組心肌組織中Cbl-b表達明顯減少，p38MAPK明顯升高，Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax相互作用均明顯減弱，單用胰島素治療僅能部分增加Cbl-b表達，減少p38MAPK的表達，增加Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax相互作用，胰島素聯合硒能夠明顯增加Cbl-b表達，減少p38MAPK的表達，并明顯增加Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax之間的相互作用，這些說明胰島素聯合硒在上調Cbl-b表達，下調p38MAPK，以及增加Cbl-b與p38MAPK、Ku70與Bax之間的相互作用是最有效的。

綜上所述，本研究結果表明，胰島素聯合硒協同抑制心肌細胞凋亡可能是通過上調Cbl-b，抑制p38MAPK激活而阻止Bax轉位來實現的。

(致謝：本研究在西安醫學院基礎部基礎醫學研究所完成。)

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Role of ubiquitin ligase Cbl-b-regulated p38MAPK in insulin and selenium synergistic anti-myocardial apoptosis in diabetic cardiomyopathy

XU Tian-jiao1, LIU Yong2, LI Ping1, XU Xiao-li1, ZENG Ju-rong1

(1.DeptofPharmacology,Xi′anMedicalUniversity,Xi′an710021，China；2.DeptofGeriatrics,XianyangHospitalofYananUniversity,XianyangShanxi712000,China)

AimTo explore the mechanism of insulin in combination with selenium preventing myocardial apoptosis in diabetic cardiomyopathy rats.MethodsSD rats(n=50) were randomly divided into five groups: control, diabetic cardiomyopathy(DCM), DCM with insulin treatment, DCM with selenium treatment, and DCM with insulin and selenium combination treatment. The cell apoptosis was observed by TUNEL. The levels of Bcl-2, caspase-3,PARP,Cbl-b and p38MAPK were examined by Western blot. The interactions of Cbl-b-p38MAPK and Ku70-Bax were detected by immunoprecipitation. ResultsInsulin in combination with selenium synergistically inhibited apoptosis，up-regulated Cbl-b，down-regulated p38MAPK expressions and increased the interactions of Cbl-b-p38MAPK and Ku70-Bax.ConclusionInsulin and selenium synergistically inhibit myocardial apoptosis by regulating Cbl-b-inhibited p38MAPK and preventing Bax translocation.

insulin；selenium；diabetic cardiomyopathy；apoptosis；Cbl-b；p38MAPK；Ku70

2016-03-10,

2016-04-15

陜西省教育廳自然科學項目(No 15JK1633)；西安醫學院重點學科建設經費資助

徐天嬌(1975-)，女，博士,副教授，研究方向：糖尿病及其發病機制,Tel:029-86177562,E-mail:xtj1118@163.com

A

1001-1978(2016)08-1170-05

R-332；R322.11；R329.25；R347.8；R542.2；R587.2；R916.3

網絡出版時間：2016-7-19 10:43網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.054.html