雪白彎頸霉產環孢菌素發酵條件的優化

周方元，蘇 丹，呂國忠，姜 娃，李琳琳

(大連民族大學環境與資源學院，遼寧大連 116600)

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雪白彎頸霉產環孢菌素發酵條件的優化

周方元，蘇 丹*，呂國忠，姜 娃，李琳琳

(大連民族大學環境與資源學院，遼寧大連 116600)

[目的]探討雪白彎頸霉(Tolypocladiuminflatum)產環孢菌素的最適發酵條件。[方法]采用正交試驗，研究不同培養時間、培養基種類、裝瓶量、菌種接種量(以菌片計)對雪白彎頸霉產環孢菌素的影響。[結果]在培養時間為4 d，發酵培養基為馬鈴薯200.00 g、甘露醇40.00 g、蛋白胨6.00 g，裝瓶量為100 mL，菌片投放為9片時雪白彎頸霉產環孢菌素的發酵條件為最優。[結論]試驗結果為提高雪白彎頸霉產環孢菌的產量提供了理論依據。

雪白彎頸霉；環孢菌素；正交試驗；發酵條件

彎頸霉屬真菌是Gams基于3個土壤絲狀真菌建立的屬[1]。按傳統分類系統，彎頸霉屬真菌被劃歸于子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目蟲草科[2-3]。Sung等[3]將麥角菌科分成麥角菌科、蟲草科和蛇形蟲草科3個科，并將彎頸霉屬劃歸到蛇形蟲草科。目前，已知某些彎頸霉是團囊蟲草屬(Elaphocordyceps)的無性型，例如，雪白彎頸霉(Tolypoclamdiuinflatum)是冬蟲夏草(E.subsessilis)的無性型[4]；Quandt等[4-5]將蟲草屬及相近屬的26個種添加到彎頸霉屬中，因此，目前已知的彎頸霉屬真菌有41個分類單元。

環孢菌素A(CYA)最初是由瑞士科學家 Ruegger等[6]從挪威哈當厄爾高原土壤中分離的雪白彎頸霉的發酵產物中分離得到的。環孢菌素A 是一種重要的選擇性免疫抑制劑，臨床上作為器官移植的抗排斥藥物，在組織器官移植過程中排異反應治療中有廣泛應用，多用于角膜移植、腎移植等的治療，另外，對其他疾病如再生障礙性貧血等的治療也有研究[7]。 環孢菌素A 的制備、劑型及功效一直是研究的重點內容，環孢菌素A產量的提高也是研究熱點[8]。鑒于此，筆者采用正交試驗研究了雪白彎頸霉產環孢菌素的最佳發酵條件，以期為提高雪白彎頸霉產環孢菌素產量提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。71株雪白彎頸霉為大連民族大學真菌資源與利用研究室保藏并提供。

1.1.2培養基?；罨囵B基(PDA)：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g，加水定容至1 L。發酵培養基：(a)馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，加水定容至1 L;(b)固體玉米漿粉30.00 g，糊精60.00 g，葡萄糖1.50 g，尿素0.15 g，加水定容至1 L，pH 4.5;(c)馬鈴薯200.00 g，甘露醇40.00 g，蛋白胨6.00 g，加水定容至1 L。

1.2方法

1.2.1菌種活化。從4 ℃冰箱中取出保存的菌種，恢復到室溫，然后將菌株分別轉接到90 mm PDA平皿上，25 ℃恒溫培養2 d，挑取菌落邊緣的菌絲接種到新培養基上，繼續培養5 d后，用直徑6 mm打孔器沿邊緣取相同菌齡的菌塊備用。

1.2.2產環孢菌素菌株初步篩選。將已經活化的菌株分別與黑曲霉菌進行對峙培養，每個試驗重復3次，3 d后觀察，采用十字交叉法測量抑菌圈平均直徑[9]，比較菌株抑菌圈直徑大小，篩選出有明顯抑菌效果的菌株，進行發酵培養。

1.2.3發酵培養。采用正交設計法[10-12]研究4個因素，即發酵時間、發酵培養基種類、裝瓶量以及菌片投放量對發酵效果，即抑菌效果的影響[13]。每個因素3個水平，所列因素與水平見表1。選取L9(34)正交試驗表。用250 mL三角瓶裝發酵培養基，發酵培養物在26 ℃、200 r/min 的搖床振蕩培養。

表1　正交試驗因素與水平

1.2.4抑菌活性檢測。采用生物檢測方法，從雪白彎頸霉發酵液對黑曲霉有無抑制作用和抑制程度來確定其中環孢菌素的有無[14]。按照正交試驗設計，分別于4、6、8 d 取出三角瓶中的發酵培養物，將其于12 000 r/min離心15 min后，去除沉淀，留下上清液備用。將滅菌的PDA培養基加熱融化，待培養基冷卻至40～50 ℃，將上清液與PDA培養基按1∶10比例混合均勻，再倒入平板中，每個處理3次重復。對照組采用等量的無菌水替換發酵液與PDA混合，靜置，冷卻。將培養2 d，未產孢的黑曲霉用6 mm的打孔器打出菌塊，將菌塊接種到發酵液與PDA混合的平板上，25 ℃培養24 h后，觀察并記錄黑曲霉菌落平均直徑。

2　結果與分析

由圖1可知，試驗組的黑曲霉菌落直徑不相同，但是全部小于對照組的黑曲霉菌落直徑，說明雪白彎頸霉發酵液全部產生了環孢菌素，并且不同因素下產生環孢菌素的量也不相同。由表2可知，極差大小為RA>RB>RD>RC，因此，以抑菌效果為考察指標，4個因素對彎頸霉產環孢菌素發酵的影響程度大小依次為培養時間(A)、培養基種類(B)、菌片量(D)、裝瓶量(C)。同時，可以得到正交試驗范圍內的最佳發酵條件為A1B3C1D3，即發酵天數為4 d，培養基為c，裝瓶量為100 mL，菌片投放量為9片。

圖1　對照組與試驗組黑曲霉菌落生長情況Fig.1　Growth situation of Aspergillus niger colonies in the CK and experimental group

試驗號Testnumber因素FactorABCD黑曲霉菌落平均直徑AveragediameterofA.nigercolonies∥cm111111.350212221.330313331.400421231.250522311.200623121.300731321.267832131.250933211.233K14.083.8763.9003.783K23.753.7803.8133.897K33.753.9333.8673.900R0.110.0510.0290.039

3　結論與討論

環孢菌素是一種有效的免疫抑制劑，隨著環孢菌素在國內外臨床移植手術中的廣泛應用，雪白彎頸霉作為環孢菌素高產菌株的一員，其發酵條件的研究也成為熱點。該研究采用正交試驗法得出，發酵時間是影響雪白彎頸霉產環孢菌素的最重要因素，在發酵時間為4 d時環孢菌素的產量最大，與梁建描述發酵時間不一致。梁建采用種子液發酵，培養基中加入0.1%的磷酸二氫鉀，由于發酵菌種添加形式和培養基的不同，導致雪白彎頸霉產環孢菌素最佳發酵條件不同。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Cyclosporin fromTolypocladiuminflatum

ZHOU Fang-yuan, SU Dan*, LU Guo-zhong et al

(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600)

[Objective] To discuss the optimum fermentation conditions for the production of cyclosporin fromTolypocladiuminflatum. [Method] Through an orthogonal experiment, the effects of culture time, culture medium, bottling capacity, and inoculation amount (in slice) ofT.inflatumon the production of cyclosporin were analyzed. [Result] The optimum fermentation conditions for the production of cyclosporin fromT.inflatumwere shown as follows: the culture time was 4 d; the fermentation culture medium was composed of potato 200.00 g, mannitol 40.00 g, and peptone 6.00 g; bottling capacity was 100 mL; inoculation amount was 9 slices. [Conclusion] The study can provide theoretical foundation for the improvement of yield of cyclosporin produced fromT.inflatum.

Tolypocladiuminflatum; Cyclosporin; Orthogonal experiment; Fermentation conditions

大連民族大學人才引進科研項目啟動基金項目(0701-110048)；中央高校自主科研基金項目(DC201502070402)；大學生創新創業訓練項目(XA201612317，XA201612315)。

周方元(1992- )，女，河北滄州人，本科生，專業：生物技術。*通訊作者，講師，博士，從事真菌多樣性研究。

2016-05-30

R 927.2

A

0517-6611(2016)19-008-02