鐵皮石斛對靈芝多糖深層發酵的影響

鄭浩然， 楊海龍

(1.溫州醫科大學仁濟學院，浙江溫州 325035；2.溫州大學生命與環境科學學院，浙江溫州 325035)

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鐵皮石斛對靈芝多糖深層發酵的影響

鄭浩然1， 楊海龍2*

(1.溫州醫科大學仁濟學院，浙江溫州 325035；2.溫州大學生命與環境科學學院，浙江溫州 325035)

[目的]研究鐵皮石斛對靈芝生長及胞外多糖分泌的影響，并分析靈芝多糖組分的變化。[方法]在發酵培養基中添加不同量的鐵皮石斛，分析靈芝生物量和胞外多糖含量的變化，并采用KTA explorer柱層析分析多糖組分。[結果]鐵皮石斛可促進靈芝胞外多糖的合成，添加量以10 g/L效果最佳；添加鐵皮石斛發酵未改變靈芝多糖的組分。[結論]在靈芝深層發酵培養基中添加適量鐵皮石斛有助于靈芝多糖的高效生產。

鐵皮石斛;靈芝;多糖;深層發酵

靈芝(Ganodermalucidum) 是我國傳統名貴中藥，現代藥理研究表明，其具有抗衰老、提高機體免疫功能、抑制腫瘤、抗病毒和保肝護肝等作用[1-4]。近年來，靈芝液體培養以其生產周期短、培養物營養豐富以及便于收集加工等優點而越來越受到重視[5-6]。中藥中含有纖維、糖類、生物堿等多種成分，有些成分可促進靈芝生長及活性物質的生產。筆者篩選出合適的中藥加入靈芝深層發酵培養基中，研究鐵皮石斛對靈芝生長及其主要活性次生代謝產物(多糖和靈芝酸)生產的影響。

1　材料與方法

1.1材料靈芝由溫州大學生命與環境科學學院發酵工程研究室篩選保存。鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)由植物組織培養法獲得，60 ℃烘干，粉碎，過60目篩。

1.2發酵培養基葡萄糖 35 g/L，蛋白胨 3.5 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO41.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，VB110 mg/L。

1.3接種和培養將培養基121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入靈芝液體種，接種量10%。搖瓶條件：250 mL三角瓶，裝液量80 mL，溫度30 ℃，轉速150 r/min，培養時間5 d。

1.4測定項目與方法①生物量：采用重量法測定；②胞外多糖：采用硫酸-苯酚法測定；③還原糖：采用DNS法測定。

1.5多糖的分離提取及組分分析發酵液離心取上清液，減壓濃縮至適當體積，加4倍體積95%乙醇沉淀，4 ℃冰箱中靜置24 h。離心，沉淀用蒸餾水溶解，Sevag法脫蛋白，以KTA explorer 快速純化系統進行多糖組分分析。色譜柱HiPrepTM16/10 DEAE，上樣量2 mL，以H2O，0.05、0.20和0.50 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，流速2 mL/ min, 分步收集，每管5 mL，采用苯酚-硫酸法進行檢測。

2　結果與分析

2.1鐵皮石斛添加量對靈芝生長和胞外多糖分泌的影響在靈芝清液培養基中添加0、5、10、15、20 g/L鐵皮石斛，考察其對靈芝生長及胞外多糖分泌的影響，結果見圖1。由圖1可知，鐵皮石斛對靈芝生長有一定的抑制作用，加入量大(20 g/L)時較明顯，但添加量在10 g/L范圍內抑制作用不明顯。在對胞外多糖分泌方面，加入10 g/L左右的鐵皮石斛對靈芝胞外多糖的生產有促進作用。

圖1　鐵皮石斛添加量對靈芝生長和胞外多糖分泌的影響Fig.1　Effects of D.candidum quantity on the growth and polysaccharide produciton of G.lucidum

2.2鐵皮石斛對靈芝發酵過程的影響在靈芝清液發酵培養基中加入10 g/L鐵皮石斛，考察鐵皮石斛對靈芝發酵過程的影響。加鐵皮石斛與不加鐵皮石斛(對照)情況下靈芝生長及胞外多糖分泌過程見圖2。由圖2可知，靈芝對鐵皮石斛的存在有一個適應過程，前40 h生長緩慢，但在此過程中胞外多糖的分泌較對照迅速，其后靈芝的生長加速，在120 h時與對照接近。為此，將添加鐵皮石斛的靈芝發酵延長其發酵時間24 h，其生物量可達對照水平。

圖2　鐵皮石斛對靈芝發酵過程的影響Fig.2　Effects of D.candidum on the fermentation process of G.lucidum

2.3含鐵皮石斛基質發酵靈芝的多糖組分分析在靈芝發酵培養基中加入10 g/L鐵皮石斛可以促進靈芝胞外多糖的生產，為考察鐵皮石斛對靈芝胞外多糖組成的影響，對清液發酵靈芝液中的多糖(GLP)、含鐵皮石斛基質發酵的靈芝液中的多糖(GDP)分別進行分離提取，并以Sevag法去除大部分蛋白，再以KTA explorer(離子交換柱)進行多糖組分分析。

表1DEAE分離洗脫各峰的胞外多糖含量

Table 1Exopolysaccharide content in each peak from the DEAE column

峰SampleGLP含量Contentmg占比Percentage%GDP含量Contentmg占比Percentage%PS13.7568.684.0565.85PS20.173.110.396.34PS30.8615.751.2019.51PS40.6812.450.518.29

3　結論

(1)鐵皮石斛對靈芝的生長有一定的抑制作用，在添加量較小(10 g/L)時抑制作用不明顯，但能刺激靈芝胞外多糖的合成。

圖3　GLP在DEAE柱上經H2O，0.05、0.20、0.50 mol/L NaCl的洗脫曲線Fig.3　The chromatography profile of GLP on DEAE column eluted by H2O, 0.05, 0.20, and 0.50 mol/L NaCl

圖4　GDP在DEAE柱上經H2O，0.05、0.20、0.50 mol/L NaCl的洗脫曲線Fig.4　The chromatography profile of GDP on DEAE column eluted by H2O, 0.05, 0.20, and 0.50 mol/L NaCl

[1] 張群豪，林志彬.靈芝多糖(GL- B)對腫瘤壞死因子α和γ干擾素產生及其mRNA表達的影響[J].北京醫科大學學報，1999，31(2)：179-183.

[2] 趙東旭，楊新林，王幫武,等.靈芝研究的若干進展[J].食用菌學報，1999，6(3)：59-64.

[3] EL-MEKKAWY S，MESELHY M R，NAKAMURA N，et al.Anti-HIV-1 protease substances fromGanodermalucidum[J].Phytochem，1998，49(6)：1651-1657.

[4] MIN B S，GAO J J，NAKAMURA N，et al.Triterpenes from the spores ofGanodermalucidumand their cytotoxicity against Meth-A and LLC tumor cells[J].Chem Pharm Bull，2000，48(7)：1026-1033.

[5] 李平作.靈芝深層發酵生產生物活性物質的研究[D].無錫：無錫輕工大學，1997.

[6] 楊海龍，章克昌.以薏苡仁為基質的靈芝液體發酵：Ⅱ.主要活性成分分析[J].中國食品學報，2006,6(5)：105-110.

Effects ofDendrobiumcandidumon the Polysaccharide Fermentation ofGanodermalucidumby Submerged Culture

ZHENG Hao-ran1, YANG Hai-long2*

(1.Renji College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035; 2.School of Life and Environment Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325035)

[Objective] To explore the effects ofDendrobiumcandidumon the growth ofGanodermalucidumandand its exo-polysaccharide production and analyze the changes of polysaccharide components.[Method]D.candidumwas added to the media, and the biomass and polysaccharide content ofG.lucidumwere analyzed.The polysaccharide components were analyzed by the column chromatography analysis of KTA explorer.[Result] The production of exopolysaccharide was enhanced byD.candidum, and 1% of addition amount was suitable.The components of exopolysaccharide were not changed byD.candidum.[Conclusion] It is helpful to enhance the polysaccharide production ofG.lucidumby the addition ofD.candidumin the submerged culture media.

Dendrobiumcandidum;Ganodermalucidum; Polysaccharide; Submerged culture

浙江省自然科學基金項目(Y3100711)。

鄭浩然(1990- )，男，江西資溪人，本科生，專業：信息系統與信息管理。*通訊作者，教授，博士，從事發酵工程研究。

2016-05-16

S 567.3+1;TQ925

A

0517-6611(2016)19-141-02