蛋雞群沙門氏菌的監測

呂殿紅，溫肖會，翟少倫，黃 忠，楊燕秋，周秀蓉，魏文康

(廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

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蛋雞群沙門氏菌的監測

呂殿紅，溫肖會，翟少倫，黃 忠，楊燕秋，周秀蓉，魏文康*

(廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

[目的]了解蛋雞場沙門氏菌的感染情況。[方法]采用沙門氏菌抗原和抗體檢測方法對2012～2015年采集的廣東省蛋雞場樣品進行檢測。采用ELISA方法對1784血清樣品進行了腸炎沙門氏菌和1 387份血清樣品進行了鼠傷寒沙門氏菌抗體檢測；采用凝集試驗方法對1 391份血清樣品進行了雞白痢沙門氏菌抗體檢測；采用細菌培養、PCR方法對采自廣東省的活雞/死雞、環境拭子等1 458份樣品進行了沙門氏菌檢測。[結果]腸炎、鼠傷寒、雞白痢3種血清型沙門氏菌抗體的陽性率分別為16.70%、10.09%和1.01%；沙門氏菌抗原檢測的陽性率為1.65%。[結論]蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等3種沙門氏菌不同程度的感染，但是蛋雞群的總體感染率不高。

沙門氏菌；感染；抗體；陽性率

沙門氏菌是常見的腸道病原菌之一，在自然界分布廣泛、種類繁多，目前已檢測出沙門氏菌血清型2 500余種，據報道在我國存在的血清型有292種[1]。沙門氏菌所導致的疾病統稱沙門氏菌感染。沙門氏菌不僅能引起動物發生急性、慢性或隱性感染，而且還能通過污染食物導致人的食物中毒，引發敗血癥等，對人類健康造成很大的威脅。在世界各國的各類細菌性食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首。2000年，在科技部和衛生部的支持下，中國疾病預防控制中心營養與食品安全所建立的全國食品污染物監測體系對食品中的污染物進行了連續主動監測，食源性致病菌的監測指標選取沙門氏菌，這是因為在我國內陸地區細菌性食物中毒的暴發例數和發病人數多年來排第1位就是沙門氏菌感染。沙門氏菌是公共衛生意義上具有重要意義的人獸共患病原菌之一，最為常見的人獸共患的沙門氏菌有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等。我國城鄉居民對雞蛋的消耗量占禽蛋消費量的85%以上，近十多年來年消耗量都超過2 000萬t[2]，如果蛋雞場存在沙門氏菌的污染，將直接影響到雞蛋的質量，對人民健康存在巨大的威脅，因此加強蛋雞場的沙門氏菌監測十分重要。筆者于2012年7月至2015年12月對廣東省部分地區蛋雞群進行沙門氏菌監測，以期為沙門氏菌的凈化和預防提供依據。

1　材料與方法

1.1樣品采集 來自廣東省的不同雞場115批次樣品，采集時間為2012年7月至2015年12月底。用于檢測腸炎沙門氏菌抗體的雞血清樣品1 784個，用于檢測鼠傷寒沙門氏菌抗體的樣品1 387份，用于檢測雞白痢沙門氏菌抗體1 391份；供檢測沙門氏菌的樣品1 458份，包括1日齡～56周齡的活雞1 222只、死亡雞48只、雞場環境拭子16份、環境和雞糞混合樣品128份、墊紙44份。以上商品代雞場均為存欄量超過10萬只以上的雞場。樣品來源和數量等具體見表1。

1.2樣品處理對用于抗原檢測的活雞、死亡雞樣品無菌取內臟及腸內容物剪碎，加入滅菌的PBS充分研磨；將環境拭子直接置于滅菌的PBS中混勻；環境和雞糞混合樣品以及墊紙搗碎后與無菌PBS充分混合，過濾后取上清待用。

對上述PBS混合液進行增菌處理：取1 mL接種于10 mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)內，于(42±1)℃培養18～24 h。同時，另取1 mL接種于10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內，于(36±1)℃培養18～24 h。

1.3試劑/試劑盒、引物和沙門氏菌陽性菌 腸炎沙門氏菌抗體(SE-Ab)和鼠傷寒沙門氏菌抗體(ST-Ab)試劑盒均為荷蘭Biochek公司產品(由北京天之泰生物科技有限公司提供)；雞白痢凝集抗原、陽性血清、陰性血清，均購自北京中海科技有限公司；沙門氏菌培養基TTB和SC、顯色培養基均為廣東環凱微生物科技有限公司產品。針對沙門氏菌侵襲蛋白 A(invasionprotein A，invA)基因，參考文獻[3]方法設計PCR引物，由上海英濰捷基生物有限公司合成。沙門氏菌陽性菌株，購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4抗體水平檢測

1.4.1腸炎沙門氏菌抗體和鼠傷寒沙門氏菌抗體的ELISA檢測。 血清樣品按1∶100的比例進行稀釋，將100 μL稀釋后的樣品添加到相應的酶標板孔內，室溫孵育30 min，倒出孔內容物，洗滌4次，最后1次倒轉反應板，在吸水紙上輕輕拍打。然后，每孔添加100 μL酶標二抗，室溫孵育30 min，洗滌4次；每孔加入100 μL底物，室溫下孵育15 min；加入100 μL終止液，終止反應，調零，使用酶標儀于405 nm波長處測定各孔吸光值。檢測時設置陽性和陰性對照，當陰性對照的平均吸光度小于0.3，陽性對照的平均吸光度大于等于0.3，二者之間的差值大于0.15，說明檢測結果可靠。S/P值=(待檢樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)/(陽性樣品的平均吸光度-陰性樣品的平均吸光度)。若S/P值≤0.499，說明樣品抗體為陰性；若S/P值≥0.500，說明樣品抗體值為陽性。

1.4.2雞白痢抗體檢測。采用平板凝集方法，用吸管吸取抗原50 μL，垂直滴加在潔凈玻璃板上，然后吸取50 μL雞血清,與抗原充分混合均勻，并使其散開至直徑為2 cm。不斷搖動玻璃板，計時判定結果，同時設置強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清對照。

1.5抗原檢測取增菌液在沙門氏菌鑒別培養基上劃線，結合培養特性，取可疑菌落接種至LB液體培養基內，提取DNA。以提取的DNA為模板，采用PCR方法[3]進行驗證試驗，擴增的目的片段為403 bp。

2　結果與分析

對采集的血清樣品進行腸炎沙門氏菌抗體、鼠傷寒沙門氏菌抗體、雞白痢抗體檢測，不同時期幾種抗體的陽性率不同(表1)。沙門氏菌在沙門氏菌鑒別培養基上呈現特征的紫紅色圓形菌落(圖1)，挑取疑似菌落進行PCR驗證，均出現目的條帶。沙門氏菌PCR鑒定的結果見圖2，沙門氏菌的分離情況及分離率見表1。

表1　不同來源樣品幾種沙門氏菌抗體和沙門氏菌的檢測結果

圖1　沙門氏菌在沙門氏菌鑒別培養基上的觀察結果Fig.1　Observation results of salmonella in differential mediums

注：M.DNA 標準DL2000；1～8.沙門氏菌鑒別培養基上疑似陽性樣品；9.陽性對照；10.陰性對照。Note：M.DNA marker DL2000; 1-8.Suspected samples in differential mediums; 9.Positive control; 10.Negative control.圖2　部分沙門氏菌陽性樣品的PCR驗證結果Fig.2　Results of PCR verification of salmonella positive samples

3　討論與結論

沙門氏菌是1885年由沙門氏等在霍亂流行時分離到豬霍亂沙門氏菌，因此定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌的存在嚴重威脅著人民的身體健康和畜牧業的健康發展其在養殖場的存在也時有報道[4-9]，對養殖業的危害很大，另外由于獸藥的濫用，導致沙門氏菌耐藥性的增強[10-11]，給該病的防治帶來很大困難。實時跟蹤監測對于有效防止沙門氏菌感染的擴散、為畜禽產品的安全提供有效保障。

該研究結果表明，廣東省部分地區蛋雞群中存在腸炎、鼠傷寒、雞白痢等幾種沙門氏菌的感染，但是雞群總體感染率不高。這可能與監測樣品多數來自大型雞場有關，大型雞場管理相對完善、飼養條件相對較好使沙門氏菌的流行傳播受阻。相對而言，小型雞場及散養雞環境較差條件較簡陋，容易流行和爆發沙門氏菌[12]，因此對小型雞場沙門氏菌的監測和防控將是今后工作的重點，建議相關部門和機構加以重視。

2012年監測結果表明，父母代的雞場環境中檢測到沙門氏菌，因此在2013年加大對雞場血清中3種沙門氏菌抗體的監測力度，并且對雞群加強飼養管理、對雞場生物安全等方面加大防控力度，2015年已經獲得改善。這充分說明了加強飼養管理和防控措施等對控制動物疫病的重要性。

該研究中檢出的沙門氏菌的24個陽性樣品，包括18個環境拭子和6個來自雛雞的肝臟和卵黃中的樣品。這與文獻[13-14]的報道相一致。筆者未對雞二蛋和蛋殼上的沙門氏菌進行監測，但是蛋雞場沙門氏菌的存在必然導致雞蛋的污染機會增多，據報道雞蛋和雞蛋殼沙門氏菌的污染率不低[15]，人們在食用雞蛋時接觸蛋殼，很容易造成間接感染，因此建議雞蛋食用前進行清潔處理。雖然我國人民習慣吃熟食，但是隨著中西文化的交流，一些外來飲食習慣(如生食等)逐漸被國人接受，因此加強沙門氏菌的控制十分重要，應切斷其傳播途徑，保障人類和動物健康。

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Monitoring of Salmonella in Laying Hens

LU Dian-hong, WEN Xiao-hui, ZHAI Shao-lun, WEI Wen-kang*et al

(Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention, Guangzhou, Guangdong 510640)

[Objective] To study infection of laying hens with salmonella. [Method] The antigen and antibody of salmonella in laying hens collected from Guangdong Province during 2012-2015 were detected. ELISA method and aggregation test were used to detect the antibody titer of serum samples aboutSalmonellaenteritidis,SalmonellatyphimuriumandSalmonellapullorum, and then germiculture and PCR were used to check out salmonella from chickens and environment swabs. [Result] Positive rates of three kinds of antibody were 16.70%, 10.09% and 1.01% respectively, while the positive rate of salmonella antigen was 1.65%. [Conclusion] The laying hens are infected with the three kinds of salmonella, but their infection rates were not high on the whole.

Salmonella; Infection; Antibody; Positive rate

廣東省促進科技服務業發展計劃項目(2012B040302010)；廣東省技術交易體系與科技服務網絡建設領域項目(2014B040404061，2016A040401012)；廣東省科技創新創業人才服務領域項目(2014A070713020)。

呂殿紅(1969- )，女，安徽來安人，高級獸醫師，博士，從事預防獸醫學研究。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導師，從事預防獸醫學研究。

2016-05-30

S 85

A

0517-6611(2016)19-163-03