miR-101、miR-223和miR-424在肺結核診斷中的價值*

顏保松，王　靜，羅　杰，陳　鳴，鄧少麗△

(1.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所檢驗科，重慶 400042；2.重慶市公共衛生醫療救治中心檢驗科　400036)

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論著·臨床研究

miR-101、miR-223和miR-424在肺結核診斷中的價值*

顏保松1，王靜2，羅杰1，陳鳴1，鄧少麗1△

(1.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所檢驗科，重慶 400042；2.重慶市公共衛生醫療救治中心檢驗科400036)

目的探尋對肺結核有潛在診斷價值的miRNA標記物。方法以健康組、肺炎組和肺癌組作為對照組，以肺結核患者作為肺結核組，采用qRT-PCR技術檢測并分析8種miRNA(miR-21、miR-29a、miR-101、miR-378、miR-146a、miR-223、miR-361-5p和miR-424)在44例肺結核組和98例對照組外周血單個核細胞中的表達差異。選取合適的miRNA采用Logistic回歸進行篩選并建立回歸方程，通過ROC曲線評價該方程的診斷效能。結果Logistic回歸篩選出3種對肺結核診斷有意義的miRNA分子即miR-101、miR-223和miR-424，ROC曲線分析顯示這3種miRNA的組合對肺結核具有良好的診斷效能：AUC=0.939，診斷特異性為81.63%，靈敏性為90.91%。結論miR-101、miR-223和miR-424可作為肺結核潛在的有診斷價值的標記物。

微RNAs；結核，肺；診斷；標記物

結核病是一個重大的全球性公共衛生問題，嚴重威脅著人類健康。肺結核是結核病中最常見的臨床類型，相比肺外結核，其能夠經飛沫播散的特性注定了其在結核病防控工作中的重要地位。然而肺結核因臨床表現多樣，影像學表現缺乏足夠的特異性，實驗室也缺乏理想的生物學指標，致使其診斷至今仍然困擾著臨床醫務工作者。MicroRNA(miRNA)是一類長度約22 nt的非編碼單鏈RNA，通過抑制或降解特異性mRNA分子介導基因轉錄后調控，參與到細胞的多種生物學進程，與許多疾病的發生、發展密切相關[1]。近年來miRNA表達及功能的相關研究表明結核病患者體內一些miRNA的表達水平發生了改變[2]，基因組學的研究結果也間接證實了上述結論[3-4]，提示這些異常表達的miRNA有可能作為診斷肺結核潛在的生物標記物。本研究選取多種已報道的表達有差異的miRNA通過qRT-PCR技術進行檢測驗證，采用Logistic回歸并結合ROC曲線進行分析，旨在篩選出對肺結核有診斷價值的miRNA分子。

1　資料與方法

1.1一般資料肺結核組44例，選自2015年9～11月就診于重慶市公共衛生醫療救治中心的住院患者；對照組98例，為同期就診于第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所的住院患者(肺炎組、肺癌組)和健康體檢者(健康組)。患者納入標準：(1)年齡18～75歲；(2)無人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及其他自身免疫性疾病，近期未接受過糖皮質激素類藥物或免疫抑制劑類藥物的治療；(3)無心、肝及腎等臟器的功能障礙；(4)健康組為無任何臨床癥狀且常規體檢未發現異常者，肺結核組、肺炎組及肺癌組均由3位經驗豐富的醫生根據臨床表現、影像學資料、微生物學結果及病理結果等作出診斷；(5)活動性肺結核組及肺炎組未經針對性治療或治療時間小于3 d，且無腫瘤及其他感染性疾病；肺癌組未經手術切除或化療時間小于3 d，且無其他腫瘤及感染性疾病。采集的臨床資料包括：所有研究對象的年齡、性別、抗酸染色結果、健康組結核T細胞斑點實驗(T-SPOT.TB)結果，肺癌組研究對象的肺癌病理類型，以及肺炎組研究對象的感染類型等。本研究經第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所及重慶市公共衛生醫療救治中心倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1　　研究對象臨床資料

-：無數據。

1.2方法

1.2.1候選miRNA的確定文獻[5-12]報道了多種在肺結核患者血清(血漿)或外周血單個核細胞(PBMCs)或淋巴細胞中存在差異表達的miRNA分子，為擴大篩選范圍，本研究忽略標本類型及對照組的因素。在經qRT-PCR技術驗證過的存在差異的miRNA分子中進行選擇，優先選擇經ROC評價證實診斷效能優良者，最終選定了8種miRNA。8種候選miRNA為：miR-21[5]、miR-29a[6]、miR-101[7]、miR-378[7]、miR-146a[8]、miR-223[9-10]、miR-361-5p[11]、miR-424[8,10]。根據上述文獻報道，與健康組比較，肺結核患者低表達miR-101、miR-146a，高表達miR-29a、miR-361-5p、miR-378、miR-424；與肺炎組(或肺癌組)比較，肺結核患者miR-21、miR-101和miR-223表達水平較低。

1.2.2PBMCs的分離抽取研究對象外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用人淋巴細胞分離液(天津美德太平洋科技有限公司)以密度梯度離心法分離PBMCs。具體操作如下：(1)用2 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等倍稀釋抗凝全血，緩慢加入到2 mL人淋巴細胞分離液的表面；(2)1 000 g常溫下離心22 min，用無菌塑料吸管小心吸取中間白細胞層；(3)用注射用生理鹽水洗滌細胞2次(800 g離心10 min)；(4)將上述分離的PBMCs加入1 mL TRIzol(Invitrogen公司)重懸混勻，充分裂解后置-80 ℃凍存備用。

1.2.3總RNA的提取及miRNA的qRT-PCR檢測使用TRIzol試劑嚴格按照說明書操作進行總RNA(含miRNA)的提取，采用NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Scientific)檢測所提取的RNA的質量和濃度，留取符合實驗要求的RNA樣本(濃度大于或等于50 ng/μL，吸光度比值A260/A280≥1.7)進行后續的qRT-PCR檢測。使用All-in-OneTMmiRNA 實時定量PCR(qRT-PCR) Detection Kit試劑 (GeneCopoeia公司)按照說明書操作進行miRNA的加尾、逆轉錄及qPCR檢測，實驗所需的內參及特異性上游引物均購自GeneCopoeia公司。qPCR反應在BIO-RAD C1000 PCR擴增儀上按以下程序進行：93 ℃預變性10 min；93 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環40次。

1.2.4數據處理以U6 snRNA作為內參對數據進行歸一化處理，設定健康組某個研究對象miRNA的表達量為1，通過2-△△CT法計算肺結核組相對對照組miRNA的表達變化倍數。考慮到影響qRT-PCR實驗結果的因素相對較多，對表達差異存在統計學意義的miRNA，本研究設定其相對表達變化倍數需大于或等于1.5或小于或等于0.5才適合作為診斷指標進入回歸方程進行分析。

1.3統計學處理采用Graphpad Prism 5.0統計軟件，根據方差是否齊性以Mann-Whitney檢驗或t檢驗比較兩組間差異，以P<0.05為差異有統計學意義。采用SPSS 19.0統計軟件以Logistic逐步向前法建立多元回歸方程，并以ROC曲線分析評價該方程的診斷效能。

2　結　　果

2.1臨床資料本研究共納入研究對象142例，其中肺結核組44例，對照組98例(健康組36例，肺炎組32例，肺癌組30例)。其中，年齡及性別在肺結核組和對照組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

n：肺結核組相對對照組mRNA表達的變化倍數。*P<0.01，與肺結核組比較。

圖18種miRNA在肺結核組和3組對照組中的表達情況

2.2PBMCs中候選miRNA的表達情況

2.2.1候選miRNA表達水平的差異肺結核組與健康組比較，miR-29a、miR-101、miR-378和miR-424的表達差異有統計學意義(P<0.05)，肺結核組低表達miR-29a和miR-101，高表達miR-378和miR-424；肺結核組與肺炎組比較，8種miRNA的表達差異均有統計學意義(P<0.05)，肺結核組的表達水平均低于肺炎組；肺結核組與肺癌組比較，除miR-29a外另外7種miRNA的表達差異均有統計學意義(P<0.05)，肺結核組的表達水平均低于肺癌組，見圖1。

2.2.2候選miRNA表達水平的變化倍數除miR-29a外，其余7種miRNA均適合進入回歸方程。miR-29a的表達雖然差異有統計學意義，但其改變倍數為0.84(肺結核組與健康組比較)和0.74(肺結核組與肺炎組比較)，不滿足實驗要求，見圖1。

2.3回歸方程的建立及ROC曲線評價回歸方程的診斷效能排除miR-29a，對剩余7種miRNA采用Logistic回歸進行分析，建立的回歸方程為：Logit(患肺結核概率P)=1.698-4.791×(miR-101)-3.428×(miR-223)+2.968×(miR-424)。ROC曲線分析證實了該模型對肺結核具有良好的診斷效能，曲線下面積(AUC)=0.939，95%CI：0.900～0.977；診斷靈敏性為90.91%，特異性為81.63%，見圖2。

圖2　　ROC曲線

3　討　　論

對肺結核進行及時準確的診斷，不僅能夠使患者盡早得到針對性治療進而改善預后，更重要的是能夠使傳染源得到及時有效的控制，避免結核病的傳播，然而近期的研究結果表明肺結核的診斷經常被延誤[13-14]。目前肺結核的實驗室診斷主要依賴于對結核桿菌自身或其成分的檢測，如痰涂片抗酸染色法、培養法，以及PCR擴增法等。這些檢測方法一方面對下呼吸道標本不易獲得的病例如小兒肺結核的診斷存在著局限性；另一方面本身也存在著諸如靈敏度較低、儀器設備要求高、檢測周期長等缺陷[15]。近年來發展起來的基于宿主免疫反應的診斷方法如γ干擾素釋放試驗(IGRA)雖可在一定程度上彌補上述不足，但是卻不能區分活動性肺結核和潛伏性結核感染[16-17]。

miRNA的相關研究為肺結核診斷提供了新的思路和方向。盡管目前已有多項關于miRNA作為肺結核診斷指標的研究報道[18]，但是這些研究在對照組的選擇上不夠全面，臨床上肺結核經常要與另外兩種常見的肺部疾病-肺炎與肺癌進行鑒別，而這些研究僅僅選擇健康人及(或)潛伏性結核感染者作為對照，缺乏足夠的說服力。本研究以健康組、肺炎組和肺癌組共同作為對照組，通過對8種候選miRNA進行檢測和篩選，最終確定了3種符合要求的miRNA分子即miR-101、miR-223和miR-424，ROC曲線分析結果顯示了這3種miRNA的組合對肺結核具有良好的診斷價值，其研究前景值得期待。

雖然本研究和Spinelli等[8]的研究結果都顯示肺結核組PBMCs中miR-223的表達水平與健康組相比差異沒有統計學意義，但是在肺組織[18]或單核/巨噬細胞[19-20]中miR-223的表達上調。上調表達的miR-223對肺結核患者具有雙重作用，(1)其可通過轉錄后調控機制抑制中性粒細胞趨化因子如CXC趨化因子配體2(CXCL2)，CC趨化因子配體3(CCL3)和白細胞介素6(IL-6)的表達，避免了大量中性粒細胞趨化至肺組織而導致的病理損傷，發揮對機體的保護作用[12]；(2)miR-223可以通過抑制巨噬細胞內核因子kB(NF-kB)的活性，降低促炎癥因子的表達[19]，以及抑制巨噬細胞凋亡等作用來削弱機體的抗結核免疫[20]。本研究結果顯示，與健康組相比，肺結核組PBMCs中miR-101表達下調及miR-424表達上調，與預期結果一致，但這兩種miRNA異常表達的原因及其在肺結核發病機制中的作用尚不清楚，有待進一步研究。

本研究觀察到8種候選miRNA中，miR-29a、miR-146a、miR-361-5p的檢測結果與預期結果不一致，推測可能以下方面的原因。(1)可能與標本類型選擇的不同有關，如miR-29a和miR-361-5p，其在血清中表達的變化趨勢可能并不能代表其在PBMCs中的變化趨勢。(2)可能與研究樣本量較小有關，如miR-146a，雖然本研究的結果顯示結核組和健康組miR-146a的表達差異無統計學意義，但是觀察兩組數據，結核組miR-146a表達量有低于健康組的趨勢，若擴大樣本量則有可能會顯現這種差異。(3)可能與所選研究人群的遺傳背景不同有關。

需要指出的是該項研究尚存在著一定的缺陷和不足。(1)該研究在實驗設計方面還不盡完善，如研究樣本量較小且研究對象來源比較單一，以及沒有采用獨立樣本或臨床前瞻性實驗設計進行效能驗證等，可能會影響到研究結論的可信性；(2)該研究最初可供篩選的候選miRNA數量僅僅只有8種，故最終確定的3種miRNA可能不是最佳的組合方案。盡管如此，本研究仍然認為該項研究具有一定的科學性和實用性，對肺結核生物標記物的深入研究具有借鑒意義和重要的參考價值。

綜上所述，本研究從8種miRNA中篩選得到了3種對肺結核有潛在診斷意義的miRNA標記物(miR-101、miR-223和miR-424)，這3種miRNA的組合對肺結核具有良好的診斷價值，該研究結果為進一步深入研究肺結核的實驗室診斷方法提供了科學的參考資料。

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The diagnostic value of miR-101,miR-223 and miR-424 as potential biomarkers on pulmonary tuberculosis*

YanBaosong1,WangJing2,LuoJie1,ChenMing1,DengShaoli1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,DapingHospital,ResearchInstituteofFieldSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,PublicHealthTreatmentCenter,Chongqing400036,China)

ObjectiveTo explore potential miRNA biomarkers for diagnosis of pulmonary tuberculosis.MethodsHealthy group,pneumonia group and lung cancer group were selected as control group,and the patients with pulmonary tuberculosis were acted as experimental group.The expression levels of 8 miRNAs (miR-21,miR-29a,miR-101,miR-378,miR-146a,miR-223,miR-361-5p and miR-424)in 44 cases of experimental group and 98 cases of control group were detected by qRT-PCR,and their differences were compared between each group.Logistic regression was applied to select diagnostic miRNA markers and set up the regression equation；ROC curve was used to evaluate the diagnostic accuracy of the equation.ResultsWe identified a panel of miR-101,miR-223 and miR-424 that yielded high diagnostic accuracy.The AUC for the miRNA panel was 0.939 with 90.91% sensitivity and 81.63% specificity.ConclusionmiR-101,miR-223 and miR-424 might be used as potential biomarkers for diagnosis of pulmonary tuberculosis.

MicroRNAs；tuberculosis,pulmonary；diagnosis；biomarker

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.010

國家自然科學基金資助項目(81371760)；國家傳染病重大專項(2013ZX10003006-003-002)。作者簡介：顏保松(1980-)，主管技師，在讀碩士，主要從事結核病研究。△

，E-mail:dengshali@tmmu.edu。

R521

A

1671-8348(2016)14-1902-04

2015-11-08

2016-02-18)