芹菜素對人舌鱗癌Tca8113細胞增殖及凋亡的影響

李　英，樸虎雄，玄云澤

(延邊大學附屬醫院口腔科，吉林延吉 133000)

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·經驗交流·

芹菜素對人舌鱗癌Tca8113細胞增殖及凋亡的影響

李英，樸虎雄，玄云澤△

(延邊大學附屬醫院口腔科，吉林延吉 133000)

目的探討芹菜素對體外培養的人舌癌Tca8113細胞增殖及凋亡的作用。方法不同濃度(20、40、80、160 μmol/L)芹菜素處理舌癌Tca8113細胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測對細胞增殖的抑制作用；Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞的凋亡率；逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測B淋巴細胞癌-2(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)的mRNA表達變化。結果芹菜素各組細胞增殖均有不同程度的抑制，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。芹菜素對Tca8113細胞增殖的抑制效果呈一定程度的時間依賴性和劑量依賴性，隨著濃度提高和作用時間延長，抑制效果更明顯(P<0.05)。對照組及不同濃度芹菜素組(除20 μmol/L)組間兩兩比較，藥物濃度越高，細胞凋亡率越顯著(P<0.05)。除20 μmol/L外芹菜素各濃度組組人舌鱗癌細胞連續培養48 h后,Bcl-2 mRNA的表達水平隨著濃度降低，而Bax mRNA表達水平增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論芹菜素對人舌癌Tca8113細胞的增殖具有抑制作用，并誘導細胞的凋亡，其機制可能與抑制Bcl-2 mRNA表達、促進Bax mRNA表達有關。

芹菜素；癌，鱗狀細胞；舌腫瘤；細胞凋亡；細胞增殖；基因，bcl-2；bax

芹菜素是一種天然黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用，尤其抗腫瘤作用較明顯[1-3]。國內外眾多學者對芹菜素的抗腫瘤作用及其機制做了大量研究，然而有關舌鱗癌方面研究報道較少。本研究檢測芹菜素對舌鱗癌細胞株Tca8113細胞增殖及凋亡的影響，對凋亡機制進行了初步探討，為人舌癌的預防及治療提供理論依據和實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料芹菜素購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基購自北京Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、50×Tae電泳緩沖液購自北京Solarbio公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國AMRESCO公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑購自上海bestbio公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)購自北京NobleRyder公司；瓊脂糖購自西班牙biowest Agarose公司；Trizol總RNA抽提試劑盒購自北京ihvitrogen公司；一步法逆轉錄PCR(RT-PCR)Kit試劑盒、Maker購自日本TaKaRa公司；溴化乙錠(EB)購自北京sybr green公司；內參照β-actin引物、B淋巴細胞癌-2(Bcl-2)引物、Bcl-2相關X蛋白(Bax)引物，購自上海生工生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞株及細胞培養舌癌Tca8113細胞株由延邊大學病理教研室提供；培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5%CO2電恒溫培養箱內常規傳代培養，裝入己滅菌的凍存管中，按4 ℃ 30 min，-20 ℃ 15 min，-80 ℃ 60 min，-196 ℃的順序逐步降溫，液氮凍存，備用。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖的影響Tca8113細胞用胰蛋白酶消化，吹打細胞成單細胞懸液，稀釋至5×104個/mL；接種于96孔培養板中，將培養板置入37 ℃含CO2恒溫箱中培養24 h，待細胞貼壁后，吸棄孔內上培養液，加入20、40、80、160 μmol/L濃度的芹菜素溶液，設為不同濃度芹菜素組，僅加等量不含芹菜素的培養液設對照組，每組6個重復孔；繼續在CO2恒溫箱中分別培養24、48、72 h，每孔加20 μL MTT，放置在5%CO2、37 ℃及飽和濕度條件下繼續CO2培養箱培養4 h，每孔加入150 μL DMSO，在避光狀態下振蕩10 min，酶標儀上設定490 nm波長,檢測每孔細胞的吸光度(OD)值，每天測量1組，連續3 d。以上操作重復3次。各濃度芹菜素組按下列公式計算：細胞生長抑制率=(1-不同濃度芹菜素組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色法應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率與MTT法相似，以細胞密度(5×104個/mL)接種于培養瓶中，每瓶約l×106個細胞，加入適量培養液培養貼壁后棄去培養液，更換等量濃度分別為20、40、80、160 μmol/L芹菜素的RPMI-1640培養基培養48 h，對照組加入等量RPMI-1640；離心收集懸浮細胞，棄去培養基，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入400 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106個/mL；將5 μL Annexin V-FITC加入細胞懸浮液中混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育，加入10 μL碘化丙啶(PI)輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min，在1 h內用流式細胞儀檢測。機械損傷細胞(Annexin V FITC-/PI+)；正常的活細胞不被Annexin V-FITC和PI染色(Annexin V FITC-/PI-)；早期的凋亡細胞僅Annexin V-FITC染色，PI染色呈陰性(Annexin V FITC+/PI-)；壞死細胞和凋亡晚期細胞可以同時被Annexin V-FITC和PI染色(Annexin V FITC+/PI+)，則早、晚期凋亡細胞及壞死細胞均計為凋亡細胞。

1.2.4RT-PCR 檢測法Bcl-2、Bax的mRNA表達同上1.2.2細胞培養，加入不同濃度芹菜素培養48 h,1.0 mL Trizol加到細胞表面，室溫下裂解細胞；冰上靜置并加入氯仿后蓋緊EP管管蓋，振蕩混勻，待溶液呈乳白狀而無分相現象后冰上靜置3 min，離心15 min；取出勻漿液，將上層無色的上清液轉移至另一干凈EP管中，加入異丙醇并充分混勻，冰上靜置，離心10 min；棄去上清液，RNA沉于管底，沿EP管壁加入75%冰乙醇，離心5 min；RNA沉淀于室溫晾干，當RNA 沉淀變透明后用30 μL去RNA酶的純水溶解RNA，溫浴10 min；待沉淀完全溶解后，置于-80 ℃冰箱保存；核蛋白儀測量RNA濃度和純度鑒定，制備的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽中，倒入1×TAE電泳緩沖液，取5 μL總RNA加樣，1.0%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，電泳膠移至紫外燈下觀察RNA是否降解來鑒定RNA完整性。β-actin引物擴增片段長度為350 bp做內參照，Bcl-2擴增片段長度為195 bp，Bax擴增片段長度為276 bp；在Microtube管中配制混合液，離心使模版RNA混合液聚集于管底部，混合物置于PCR儀上進行變性、退火反應；冰浴條件下，在PCR儀上進行反轉錄反應；拍打PCR管，混勻，在PCR儀進行擴增；瓊脂糖凝膠的制備后入電泳槽中進行電泳40～60 min后，膠塊置于紫外凝膠圖像分析儀下觀察，掃描。成像分析ImageJ軟件測定各條帶的光密度值,每組試驗做3個平行重復，以3次重復的平均值為依據，計算樣品中目的基因β-actin擴增條帶的光密度值比值。

2　結　果

2.1MTT法檢測芹菜素對Tca8113細胞增殖的抑制效果芹菜素各組細胞增殖均有不同程度的抑制，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。芹菜素對Tca8113細胞增殖的抑制效果呈一定程度的時間依賴性和劑量依賴性，隨著濃度提高和作用時間延長，抑制效果更明顯(P<0.05)，見表1。

表1　芹菜素不同濃度、不同時間對Tca 8113細胞抑制率(%)

a:P<0.05，與24 h比較；b:P<0.05，與對照組比較。

2.2流式細胞術檢測芹菜素作用于Tca8113細胞48 h凋亡率試驗結果表明，除了20 μmol/L外,隨著藥物濃度提高，芹菜素對Tca8113細胞早期、晚期及總凋亡率均有上升趨勢。對照組及不同濃度芹菜素組兩兩比較表明，隨著藥物濃度提高，細胞凋亡率更為顯著(P<0.05)，見表2、圖1。

表2　芹菜素作用48 h后不同濃度對Tea8113細胞凋亡

a:P<0.05，與對照組比較。

2.3PCR-RT檢測芹菜素作用48 h時Tca8113細胞Bcl-2、Bax的mRNA表達變化除20 μmol/L外，芹菜素各濃度組組人舌鱗癌細胞連續培養48 h后,Bcl-2 mRNA的表達水平隨著濃度降低，而Bax mRNA表達水平增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖2。

表3　不同濃度Bcl-2、Bax mRNA光密度值分析

a:P<0.05，與對照組比較。

A：對照組；B：芹菜素20 μmol/L組，48 h；C：芹菜素40 μmol/L組，48 h；D：芹菜素80 μmol/L組，48 h；芹菜素160 μmol/L組，48 h。

圖1流式細胞儀檢測結果

A：48 h后Tca8113細胞Bcl-2 mRNA的表達；B：48 h后Tca8113細胞Bax mRNA的表達；C：48 h后Tca8113細胞β-actinm RNA的表達。

圖2PCR-RT檢測結果

3　討　論

芹菜素作為一種植物源性抗腫瘤藥物，且具有毒副作用小的優點，成為有開發前景的天然腫瘤藥物，是腫瘤研究界的新焦點[3-5]。Choi等[6]研究發現，在濃度為20～160 μmol/L芹菜素分別作用在乳腺癌MDA-MB-453細胞24、48、72 h，芹菜素對乳腺癌MDA-MB-453細胞增殖的抑制作用有明顯的劑量和時間依賴性。蔡婧等[7]研究發現不同濃度的芹菜素作用下培養肝癌Huh-7細胞，其抑制率差異有統計學意義。本研究采用MTT法檢測芹菜素對人舌癌Tca8113細胞增殖的抑制情況，試驗結果顯示，相同藥物濃度下不同時間、相同時間下不同濃度芹菜素組與對照組間差異有統計學意義，而且芹菜素對舌癌Tca8113細胞的增殖的抑制作用呈的一定的時間、劑量依賴性，與乳腺癌、肝癌方面研究報道一致[6-7]。

細胞凋亡是指細胞在一定生理或病理條件下出現的程序主動性、生理性死亡過程，Annexin V-FITC與PI雙標記結合流式細胞術是檢測體外細胞凋亡的比較常用的方法。但其缺點是晚期凋亡細胞與壞死細胞之間區分較為困難，若研究凋亡或是壞死本身通路等方面，需進行進一步相關研究。本研究雖然將晚期凋亡細胞及壞死細胞均統一計為晚期凋亡細胞來進行計算，但僅早期凋亡與對照組相比具有統計學意義，不同濃度芹菜素組總凋亡率也明顯高于對照組。Moghaddam等[8]、李明勇等[9]檢測芹菜素作用于人胃癌BGC823 細胞、人鼻咽癌CNE-2Z細胞，證實隨著濃度增加，細胞的凋亡率有上升趨勢。本試驗結果表明不同濃度芹菜素對Tca8113細胞作用48 h，除20 μmol/L外其他組芹菜素濃度依賴性地誘導凋亡，與文獻報道一致。

細胞凋亡過程中多種基因將會被激活、表達及調控,從中出現抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類相關的基因，而在此過程中Bcl-2、Bax基因備受關注。Bcl-2是目前最受重視的調控凋亡細胞的基因，也是與凋亡有關的基因主要調節者。Bax基因的作用與Bcl-2基因相反，是促凋亡基因，它的過表達可使拮抗Bcl-2的促進細胞增殖及抑制凋亡的作用。編碼的Bax蛋白可自身形成同源二聚體誘導凋亡，而且將與Bcl-2蛋白及Bcl-x1蛋白形成異源二聚體，導致加速細胞凋亡發生[10-11]。研究發現，芹菜素作用于肺癌A549細胞、人胃癌細胞，上調細胞Bax的表達、下調Bcl-2 表達，且呈劑量依賴性[12-13]。李衛林等[14]結果表明，人前列腺癌PC-3細胞裸鼠移植瘤中芹菜素中、高劑量組能促進Bax的表達、抑制Bcl-2的表達。本試驗通過RT-PCR檢測，人舌鱗癌細胞連續培養48 h后，除20 μmol/L外其他濃度芹菜素組與對照組相比，Bcl-2、Bax mRNA的表達水平均差異有統計學意義，這表示降低Bcl-2 mRNA表達、上調Bax mRNA表達是芹菜素在一定濃度下誘導Tca8113細胞發生凋亡的機制之一。

綜上所述，芹菜素作為一種植物提取物的活性成分，能夠有效抑制舌鱗癌Tca8113細胞增殖，誘導細胞凋亡，提示芹菜素對舌鱗癌有一定防治作用，且對芹菜素的進一步研究打下基礎。

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李英(1987-)，住院醫師，碩士，主要從事口腔頜面外科腫瘤研究。△

,Tel:13943322882；E-mail:xuanyunze@sina.con。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.035

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1671-8348(2016)13-1828-04

2015-11-23

2016-01-26)