豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結構的同源模建*1

楊　琳，趙琴平，楊力權（.武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 43007；2.云南省大理白族自治州血吸蟲病防治研究所，云南 大理 67000；3.大理大學農學與生物科學學院，云南 大理 67003）

豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結構的同源模建*1

楊琳1，2，趙琴平1，楊力權3*
（1.武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430071；2.云南省大理白族自治州血吸蟲病防治研究所，云南 大理 671000；3.大理大學農學與生物科學學院，云南 大理 671003）

通過同源模建方法構建豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的三維結構模型，并對其結構進行分析。結果表明，TsCL-1的結構模型具有半胱氨酸蛋白酶CA族典型的α/β折疊模式，結構骨架主要由兩個不同的結構域組成。結構模型具有保守的半胱氨酸催化三聚體 （Cys25-His163-Asn183），催化三聚體位于兩個結構域的表面，結構模型中存在3對二硫鍵。研究結果將為進一步深入研究TsCL-1的結構和功能關系奠定結構基礎。

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1；結構模型；同源模建；結構功能研究

。

豬囊尾蚴病 （Cysticercosis cellulosae）又稱豬囊蟲病。它是由豬帶絳蟲 （Taenia solium）的幼蟲——豬囊尾蚴 （Cysticercus cellulose）寄生于中間宿主體內而引起的一種人獸共患寄生蟲病［1，2］。在人體內，豬帶絳蟲與兩個明顯的感染階段有關，即：腸道感染 （由于成蟲在宿主腸道寄生所致，也稱絳蟲病）和肌肉或組織感染 （由于囊尾蚴進入宿主肌肉或組織內所致，也稱囊尾蚴病）［3］。由于豬囊尾蚴幼蟲寄生于人體的位置和數量不同，可導致不同的臨床癥狀，給人類健康帶來嚴重危害［4］，尤以腦囊尾蚴病為甚。

近年研究表明，由寄生蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶 （Cysteine Protease，CP）在寄生蟲入侵宿主、寄生蟲免疫逃避機制及寄生蟲治療中發揮了重要作用，得到了廣泛的關注［3，5，6］。半胱氨酸蛋白酶TsCL-1是由豬囊尾蚴分泌的一種半胱氨酸蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶CA蛋白酶中的C1族蛋白酶。研究表明，在酸性環境中，它是降解宿主IgG的主要酶，而宿主IgG可能是T.solium幼蟲的主要氨基酸來源，因此它被認為是入侵宿主的重要因子之一［3，7］。目前，通過基因工程技術，TsCL-1的氨基酸序列已經被測定，對其蛋白酶的生物化學特性和反應優化條件等也進行了一定研究［3］。但由于其晶體結構未被測定，因此對其與宿主相互作用機制還未進行廣泛深入的研究。本文通過同源模建技術構建豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的三維結構模型并對其結構進行分析，為在分子水平上揭示豬囊尾蚴蟲半胱氨酸蛋白酶與宿主的相互作用機制和致病機理奠定基礎。

1.材料和方法

1.1原理

同源模建［8］是基于序列-結構相似性原則，通過模板蛋白構建待測蛋白質的三維結構模型。當蛋白質序列的一致性大于30%，便可以利用模板蛋白的結構來建立靶蛋白的三維結構［8］。同源模建的原理基于兩點：蛋白質的結構由其氨基酸序列唯一決定；蛋白質的結構在進化中更穩定，結構變化比序列變化要慢得多，因此序列上的相似性導致同源蛋白具有相似的三維結構，并且進化上距離較遠的相關序列仍可折疊成相似的結構。

1.2序列比對和模板蛋白

豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的序列在UniProtKB數據庫中獲得 （序列號為Q6R3Q1），去掉信號肽和先導肽殘基，得到包含216個氨基酸殘基的成熟TsCL-1序列。在Biology Workbench生物平臺中［9，10］，以成熟TsCL-1序列作為查詢序列，使用PSI-BLAST［10］進行序列搜尋和比對，得到的最接近序列為PDB編號1CS8的序列。TsCL-1與1CS8的序列比對結果顯示 （圖1），序列一致性達到57% （Identities=127/220（57%），Positives=156/220（70%），Gaps= 6/220（2%））。1CS8是一種來源于人類的半胱氨酸蛋白酶，同樣屬于CA蛋白酶中的C1族蛋白酶。鑒于TsCL-1與1CS8具有較好的序列一致性，選取1CS8的晶體結構作為模板蛋白。

圖1　TsCL-1與1CS8序列比對結果

TsCL-1與1CS8序列比對結果，Query序列為TsCL-1序列，Sbjct序列為1CS8序列。

1.3同源模建及能量優化

本文采用Modeller9.11［11］同源模建軟件包來構建半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結構模型。模建時使用自行編寫的Modeller腳本文件“align2d.py”對靶序列 （TsCL-1序列）與模板序列 （1CS8序列）進行序列比對，比對后進行手工調整使兩者的保守位置盡量對齊，以保證模建結構的準確。隨后用自行編寫的Modeller腳本文件“model-single.py”，生成5個TsCL-1結構模型，采用模擬退火算法對結構進行能量優化，采用分子概率密度函數molpdf對模型進行評估。

2.結果和討論

2.1模建結構模型的評估

把能量最小化后的TsCL-1分子結構模型用Procheck［12］進行模建結構的評價。得到了相應的評價結果和Ramachandran圖 （圖2）。結果顯示，其中85.6%的氨基酸處于最適區，12.2%處于較合適區，1.1%處于可接受區，1.1%處于不合理區。由此可見，98.9%的氨基酸殘基分布在Ramachandran圖的二面角合理區域，也就是說98.9%的氨基酸構象是可以接受的，說明模建的結構合理。

圖2　TsCL-1結構模型的Ramachandran圖

此圖通過Procheck得到，區域1代表最適區域；區域2為較合適區域；區域3為可接受區域；區域4為不合理區域。

2.2半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結構模型分析

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結構模型主要包含兩個不同的結構區域 （圖3），一個結構域以α-螺旋為主要結構，另一個以反平行的β片層為主要結構。催化三聚體由Cys25，His163和Asn183組成，催化三聚體位于兩個結構域的表面。在TsCL-1結構模型中存在3對二硫鍵，分別由Cys22和Cys65、Cys56和Cys97、Cys156和Cys205構成。

圖3　半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結構模型

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結構模型。結構中的R區域、L區域、催化三聚體殘基、二硫鍵已在圖上標注；催化三聚體殘基用棍狀模型表示。

整體上看，半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結構模型具備半胱氨酸蛋白酶CA族典型的α/β折疊模式，即結構骨架主要由兩個不同的結構域所組成，一個以α-螺旋為主要結構的L區 （L domain），另一個以反平行β片層為主要結構的R區 （R domain），催化三聚體 （Cys25-His163-Asn183）位于兩個結構域的表面［13，14］。其催化三聚體的催化機制主要是：Cys25充當進攻底物的親核基團，Cys25在His163的作用下發生去質子化，而Asn183的作用是幫助His163中的咪唑環定位，使得去質子化可以發生；Cys25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，形成酰基-酶四面體中間體；接著酶與一個水分子作用，發生去酰基化，并釋放肽鏈的羰基末端［15］。結構模型中包含有3對二硫鍵，以往研究表明，多種因素共同維系和影響著蛋白酶結構的穩定，如二硫鍵和氫鍵等都在保證其整體結構的穩定性上有著重要作用［16，17］。本文的研究結果將為進一步深入研究TsCL-1的結構和功能關系奠定結構基礎。

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（責任編輯徐成東）

Structure Homology Modeling of Cysticercus Cellulose Cysteine Protease TsCL-1

YANG Lin1，2，ZHAO Qinping1&YANG Liquan3
（1.School of Basic Medical Sciences，Wuhan University，Wuhan，430071，Hubei Province；2.Dali Institute of Schistosomiasis Prevention and Control，Dali，671000，Yunnan Province；3.College of Agriculture and Biological Science，Dali University，Dali，671003，Yunnan Province）

In this article，structuralmodel of Cysticercus cellulose cysteine protease TsCL-1 is constructed and analyzed.The results show that the structuralmodel of TsCL-1 has the commonα/βscaffold characteristics of the clan CA proteases of Cysteine Protease，which contains twomain structural domains. The catalytic triad residues Cys，His and Asn are completely conserved（Cys25-His163-Asn183）.The structuralmodel has three disulfide bonds.The results of this article will provide a solid basis for further studying the relationship between structure and function of TsCL-1

Cysteine protease TsCL-1；structuralmodel；homologymodeling；structure and function relationship

Q556.9

A

1671-7406（2016）03-0037-04

2016-01-13

楊琳 （1980—），女，碩士研究生，主要從事寄生蟲診治方面的工作和研究。

楊力權 （1980—），男，博士，副教授，主要從事結構生物學方面的研究。