一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

■ 田海軍李世偉2（ 信陽農林學院水產學院 464000；2 廈門利洋水產科技有限公司 350200）

一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

■ 田海軍1李世偉12（1 信陽農林學院水產學院 464000；2 廈門利洋水產科技有限公司 350200）

圖1 發病草魚

圖2 病原菌分離與純化培養

圖3 分離菌革蘭氏染色

草魚，屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，俗稱鯇魚。因其生長迅速、餌料來源廣泛，并且生長迅速、產量高，成為中國淡水養殖的四大家魚之一。草魚是我國特有魚類，但以其獨特的食性和覓食手段從而被當做拓荒者移植到世界各地。草魚養殖過程中容易患上爛腮、腸炎、赤皮、病毒性出血病等多種疾病，細菌性病原致病的情況很嚴重，因此，通過對草魚細菌性疾病的病原菌分離與鑒定對草魚病害的防治具有較大意義。

1 材料和方法

1.1 發病草魚

今年3月，廣東珠海一草魚養殖池塘開始出現草魚死亡，池塘面積8畝，3臺葉輪式增氧機，水深1.8 m，7,500 kg魚，養殖前沒有清塘，從3月中期開始，每天死亡十幾條，觀察發病草魚，魚體表發紅，尾鰭發白，鰓蓋、鰭條充血，剪開肚子有腹水，肝臟發黑，腸空、發紅（如圖1）。

1.2 實驗材料

LB固體培養基、70%酒精、冰箱、恒溫培養箱、壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、培養皿、燒杯、研缽、試管、接種環、酒精燈等。

1.3 病原菌的分離與純化培養

在無菌條件下，先用70%酒精對魚體表面消毒，然后分別取草魚的肝臟、腎臟、脾臟于無菌研缽中搗碎。

分別加少量無菌水后分別劃線接種于LB固體培養基平板上，放入28℃恒溫培養箱中培養24h。

選取平板上的優勢菌落進行純化培養，最終培養至3～5代后獲得形態一致的純菌落。

選取單個菌落經過涂片、HE染色、鏡檢，確認為純培養物。

選取一個優勢菌落，在LB固體培養基斜面上-80℃冰箱保存（通過抑制酶的活性來抑制細胞的生命活動的方式延長細胞存活時間），備用。

1.4 分離菌菌落觀察

將純培養物接種于LB固體培養基平板上，在28℃恒溫培養箱中培養24h，觀察并記錄培養出的細菌菌落特征。將獲得的純培養物進行革蘭氏染色：在載玻片上加1滴無菌水，用接種環挑取少許菌落與無菌水混合并進行均勻涂布；經自然干燥、火焰固定后，用草酸銨結晶紫染液染色1～2min，加水沖洗；再加革蘭氏碘液后1～2min，加水沖洗，再加復紅酒精染液等50～60s后加水沖洗；等待干燥后鏡檢。菌體被染成紫藍色為陽性，被染成紅色則為陰性。

1.5 病原菌的鑒定

采用API細菌數值鑒定系統，這是同時能測定20項以上生化指標，可用做快速鑒定細菌的長形卡片（21cm×4.5cm，法國生產），上面排列著20個塑料管，管內加有適量糖類等生化反應的干粉（有標簽表明）以及反應產物的顯色劑。每份產品都有薄膜覆蓋，這樣保證無雜菌污染。

使用時，首先打開內部附有的一瓶無菌基本培養基（液體），用來稀釋待鑒定的純菌落；

把配制成的濃度適中的細菌懸液用無菌滴管逐個以0.1ml的量加入到每個小管中；

在經過24～28h保溫后，觀看每個小管是否發生了顯色反應；

將結果記錄在相應表格中，然后按照規定對結果進行編碼、查檢索表，就可以獲得該菌種的鑒定結果。

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗采用的是紙片法（購自杭州某微生物試劑公司），選用在生產上常用的藥物進行試驗研究。

首先進行細菌培養，用無菌生理鹽水洗后吸取0.2mL菌液在LB固體培養基平板上進行均勻涂布。

貼上藥敏紙片，設4個平行實驗組。

放置于28℃的恒溫培養箱中培養24h。

觀察有無抑菌圈產生，同時記錄抑菌圈直徑，計算其平均值；然后再重復做1次實驗；最后依據抑菌圈直徑比值照判斷標準得到藥敏實驗結果。

1.7 臨床用藥

根據藥敏試驗結果和池塘情況使用藥物治療

2 結果

2.1 病原菌分離與純化培養結果

在LB固體培養基上形成菌落為其菌落形態：圓形、圓滑、濕潤邊緣整齊、微凸、半透明、灰白色至淡黃色中等大小的菌落，易挑取（見圖2）。

2.2 分離菌鏡檢結果

革蘭染色陰性，短桿菌，懸滴標本觀察動力，運動活潑（見圖3）。

2.3 分離菌生理生化試驗結果(見表1)

表1 細菌生理生化試驗結果

2.4 藥敏試驗結果

分離菌藥敏試驗結果（見表2）。

表2 藥敏試驗結果

2.5 臨床治療結果

用藥：第1d， 陰雨天，死亡15條左右，上午10點，使用諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制劑（1包）拌兩包料。

第2d，陰雨天，死亡6條，下午17點，諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制劑（1包）拌1包料。

第3d，陰天，死亡6、7條，上午10點喂諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制（劑1包）拌2包料。

草魚死亡量明顯減少得到控制。

3 討論

根據分離菌的形態特征、培養特性和生化特性等試驗結果確定該分離病原菌為氣單胞菌。氣單胞菌，廣泛分布于自然界中，能從表層和地下來源的飲用水中分離出該菌，氣單胞菌屬已經被國際上列為腸道致病菌之一，是危害草魚的主要病原菌之一，感染后可發生胃腸炎、外傷感染和敗血癥并具有高死亡率。試驗從草魚的肝脾腎等組織中分離出了氣單胞菌，為臨床治療提供了理論依據。但由于時間等多種條件限制，不能做回歸實驗。

由藥敏試驗結果可知病原菌對諾氟沙星、鹽酸小檗堿、氟甲喹、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感。臨床上選用這些高敏藥物進行治療，根據藥物特性采用了拌料口服的方式。諾氟沙星（Norfloxacin）化學名為1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，作用原理為通過作用于細菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復制而導致細菌死亡，是氟喹諾酮類抗菌藥，對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高。鹽酸小柴堿是小檗堿（Berberine）的鹽酸鹽（俗稱鹽酸黃連素），小檗堿分子式[C20H18NO4]+，是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素，存在于小檗科等4科10屬的許多植物中，抗菌譜廣，體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用，臨床主要用于腸道感染及菌痢等。

具體治療：因前期沒有清塘，草魚出現死亡后用了絮凝的凈水產品，使塘底滋生了更多的有害細菌。后來又用了很多殺蟲的藥物，破壞了水體的生態平衡，加上一直陰雨天氣，池塘自凈能力差，溶氧一直不高，建議首先控制好死亡量，然后改善好池塘環境，最后再根治魚病。在注意增氧的前提下連續3d每天1包鰓皮腸利康拌料，草魚食欲恢復，死亡數量明顯減少。

氣單胞菌致病是由多種致病因子協同作用的結果，指導臨床用藥時為防止濫用抗生素而引起的病原菌抗藥性問題，對分離的病原菌用藥敏試驗測定后再合理選用藥物治療才能達到最好的效果。該菌以往被認為是低毒力條件性病原菌，但近年來該菌引起感染性疾病的報道日益增多，并對多種抗生素產生不同程度的耐藥性，需要加以重視，注意衛生等各方面管理。臨床上，早發現，早治療，防止多種病原交叉感染，提高機體抵抗力，科學養殖。（參考文獻略）