大鯢性腺發育中激素水平及產卵效果分析

■ 孫宇 肖調義（湖南農業大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128）

大鯢性腺發育中激素水平及產卵效果分析

■ 孫宇 肖調義（湖南農業大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128）

大鯢屬于由水生脊椎動物向陸生脊椎動物過渡的類群，其結構比較原始、獨特，在研究動物進化過程和地理分布范圍等方面有著重大的科學價值，有“活化石”之稱，是國家二級保護野生動物。2002年以前，大鯢人工養殖的甚少，繁殖也很少。隨著研究的深入和技術的成熟，2002年以后繁殖技術漸漸成熟（章克家，2002；余東勤，2009）。目前人工大鯢養殖規模最大的是陜西漢中市，劉愛華在2007年報道全市大鯢存量約為10萬尾，2009年大鯢的養殖總量超過100萬尾，且繁殖產量占全國比例的70%（刑可利，2001），同年湖南省養殖企業已有35家左右，大鯢繁殖量在4萬～5萬（羅慶華，2009）。截至2012年底，貴州大鯢存池量為43.5萬尾左右，僅次于陜西；張家界市養殖估規模也超過40萬尾，至2014年，全國存量達到400萬尾，人工繁殖和馴養大鯢對于大鯢資源保護和有效利用極其有利。

當前，在大鯢的人工繁殖過程中繁殖率較低，人工繁殖工作中關鍵點即是對親本成熟情況的準確掌握； 對此，陽愛生等 （1981） 對大鯢性腺發育過程在組織學層面進行了觀察，楊焱清等 （2003） 選用彩色多普勒儀檢測雌性大鯢卵徑的大小用來檢驗其性腺發育整個過程，這些研究者的研究結果在一定程度上為探尋大鯢成熟情況提供了理論基礎，但也存在著局限性，如對親本會造成損傷、檢測準確度不夠等。睪酮 （TT） 和雌二醇 （E2）是動物體內固有的2 種性激素，其功用是調節動物的生長發育和生殖行為，對確定動物成熟度非常關鍵（汪小東等，2000；鄧利等，2001；張利紅等，2001；何正侃等，2003）。本實驗通過檢測大鯢親本體內睪酮和雌二醇含量的變化，旨在尋求大鯢成熟情況的有用檢測方式，為其規模化繁殖奠基理論基礎。

表1 E2檢測結果表

表2 T值檢測結果

1 材料與方法

實驗大鯢親本為湖南億年酉魚公司自繁自養的二代親本，鯢齡為 2004年人工繁殖挑選培育且經過連續 3 年以上人工催產繁殖，人絨毛膜促性腺激素 （HCG） ELISA 試劑盒、人雌二醇 （E2） ELISA 試劑盒和人睪酮（T） ELISA 試劑盒等試劑盒均購買于上海銳聰實驗室設備有限公司，檢測儀器為北京 DNM-9602 型酶標分析儀。

2 樣品采集與測定

根據歷史繁殖資料抽取4組產卵產精效果好大鯢，4組產卵產精較差大鯢，和4組隨機抽取的大鯢，并于每月7～10日期間，于 8∶00 左右采集尿樣。操作時使親本大鯢的腹部朝上，然后用毛巾擦干或者吸干泄殖孔周圍的水漬，再用去掉針頭的10mL注射器插入泄殖孔內1.0cm左右的深處，同時用手輕輕擠壓大鯢的腹部，收集尿液，采集后編號直接進入實驗室進行檢測，所有檢測均嚴格按照儀器操作規程和試劑說明書進行，同時此實驗鯢在2014年人工催產中按原有技術體系進行分類，并分不同時間點進行催產授精孵化，并對每一尾鯢所產卵與所授精卵進行獨立的記錄和分區存放。

本實驗采用酶聯免疫法（ELISA） 檢測大鯢尿液中雌二醇（E2） 和睪酮 （T） 這2種激素水平。酶聯免疫法的基本原理是讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來定量檢測。具體來說即將 E2 和 T 單克隆抗體包被于固相表面，再在固相抗體中加入要檢測的尿液，尿液中 E2 和 T與之接觸后，迅速形成抗原抗體復合物并附著于固相載體上，然后再加用辣根過氧化物接的 E2 和 T 抗體，再次形成抗體一抗原一酶聯抗體復合物，即雙抗體夾心復合物。洗去過量沒有結合的酶聯抗體，最后加人酶的作用底物與顯色劑，觀察顏色變化。反應結果的顏色深淺與尿液HCG、E2 和 T濃度呈正比。

3 實驗結果

E2 的檢測結果及檢測圖如表1所示。數據顯示大鯢尿液中E2值的變化存在明顯的周期性，湖南中部地區在5月時均值為33.5pmol/L，6月提高到了47.7pmol/L，7月時達到59.5pmol/L，7月下旬到8月上旬時達到頂峰均值為83.3ng/mL，隨后即開始下降分別為69.6pmol/L，54.7pmol/L，50pmol/L，并以41pmol/L進入越冬期，且產后激素水平下降速度加快。通過 7月20日和 8 月 10 日兩次催產表明在 7 月底8 月初催產時效果最佳，催產率達到86%，且產卵量大，經產順利，時間過早過遲產卵效果均比較差。

T值檢測結果及圖譜如表2所示。數據顯示大鯢尿液中T值的變化存在明顯的周期性，湖南中部地區在 5月時均值為 238.1pg/mL，6月均值為 281pg/ mL，7月時達到310.2pg/mL，8 月時達到頂峰360pg/mL，9月時開始明顯下降均值為214.5pg/mL，之后分別為190.3pg/mL，174pg/mL進入越冬中。通過7月20日和 8月10日兩次催產在湖南地區氣候天7月底8月初是最佳的催產時間，但如在7月時其激素水平未能達到290pg/mL時，其基本催產不產精，且在300pg/mL左右時精子質量也略顯差。

4 討論

4.1 雌二醇（E2）和睪酮（T）含量與時間變化

本次研究結果顯示，大鯢尿液中雌二醇和睪酮含量呈現出周期性變化，表現為在生殖季節前逐漸達到高峰，繁殖期過后逐漸降低到正常值，基本呈現出拋物線變化，高峰在 7 月下旬到 8 月中旬，且結果表明雌性大鯢峰值略早于雄鯢，此結果與很多研究結論基本一致（陽愛生，1981；肖漢兵，1995；楊焱清，2003）。大鯢的雌二醇和睪酮含量達鼎盛時期后，不論是否進行人工催產或者是否產卵產精，雌二醇和睪酮含量均會降低；這就不難看出，大鯢性腺發育是一個從生長發育—成熟—退化—生長發育的一個相對固定、循環往復的生殖生理過程，達到性腺成熟的高峰是7 月中下旬。

4.2 雌二醇和睪酮含量與人工催產效果

當在7月時雌二醇含量大于55.8 pmol/L時，雌性個體在外來激素的作用下，均可產卵，且產卵效果都較好，低于此值則可能不產卵，或產出空膠帶，但雄鯢性成熟E2臨界點暫不能準確確定需下一步更準確的研究對比。值得指出的是，當E2含量＞90 pmol/L，若其含量繼續上升，選擇恰當的時間催產不但會使催產效果好，并且受精率得到提高，若E2含量從最高點迅速減少，雖然能夠產出卵粒，但大多產卵不會順利，卵質黃白相間，混濁，且受精率不高，甚至不能受精。雄性睪酮在7月時含量＞280pg/ mL時，在外來激素的作用下也均可產精，且精子活力與量均較好，但如含量在320pg/mL以上時建議最好安排7月催產不宜進入8月，否則其產精效果明顯差，且死亡體，殘體精子多。大鯢人工催產試驗還顯示，在19℃～21℃的水溫條件下，雄性大鯢催產效應期過后能采到成熟精子的時間為3～5d，此時受精成功的機會最高，無論提前或超時其基本不授精，因此為確保大鯢人工繁殖成功，夏季水溫應該盡量控制在 20℃以下為宜。

4.3 睪酮含量與副性征

副性征是生物體在繁殖期所表現出來的特有癥狀，雄性大鯢的副性征是生殖孔內緣兩側有 2 排白色的小突起，成熟良好時，多數在生殖孔周圍出現“桔瓣狀”的光滑肌肉隆起圈，并伴有白點變紅或肛門四周皮膚泛紅等情況。本研究結果表明，凡具有雄性副性征的個體均能檢測到T值；不管雌鯢還是雄鯢，副性征越明顯，檢測出的TT 值越高。

5 結論

當大鯢尿液中雌二醇（E2）值在90pmol/L時所產卵質量最好，授精與產苗最高，雄鯢睪酮（T）值在280pg/ mL時精子活力最好授精與產苗最高。（參考文獻略）