酶聯免疫法快速檢測水產品中磺胺類藥物殘留

■ 林品言 杜紅梅（常德市畜禽水產品質量安全檢驗檢測中心，湖南常德 415000）

酶聯免疫法快速檢測水產品中磺胺類藥物殘留

■ 林品言 杜紅梅（常德市畜禽水產品質量安全檢驗檢測中心，湖南常德 415000）

磺胺類藥物是人工合成的具有氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，它是應用廣泛的抗菌素，對畜禽疾病控制和治療起到重要作用。但磺胺類藥物存在嚴重副作用，人體中長期存在磺胺類藥物會導致許多細菌對磺胺類藥物產生藥性，且有潛在的致癌性。我國農業部第235號文件規定其殘留量為100μg/kg。

目前，用于檢測磺胺類藥物殘留的分析方法較多，包括液-質聯用法、氣-質聯用法、酶聯免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。酶聯免疫法作為一種快速篩選方法，具有檢測速度快、操作簡便、靈敏度高等優點，被廣泛用于現場監控和大批量樣品的初篩，在動物性食品的獸藥殘留檢測中得到廣泛地應用。

圖1 磺胺類藥物的標準曲線

1 材料與方法

表1 樣品中磺胺類藥物殘留

表2 樣品中磺胺類藥物殘留的回收率及相對標準偏差

1.1 材料與儀器設備

1.1.1 材料

試驗用水產品：市售，將魚去皮，去骨，沿背部切下肌肉塊，放入勻漿機中絞碎并混勻，置于-18℃冰箱中冷凍備用。

1.1.2 儀器

MK3酶標儀；XW-80A微型旋渦混合儀；CP153C電子天平；GP-125BE干燥培養箱；TG16K-II高速離心機；XW-80A 微型旋渦混合儀；量筒、試劑槽、離心管、吸水紙巾、移液槍。

1.1.3 試劑

磺胺二十五合一酶聯免疫（ELISA）快速檢測試劑盒；正己烷（分析純）；乙酸乙酯（分析純）；中性氧化鋁100目-200目。

1.1.4 試劑盒組成

包被有磺胺類藥物偶聯抗原的微孔板：96孔（8孔/條×12條）；磺胺類藥物標準品溶液：6×1mL/瓶（0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/ L）；磺胺抗體工作液：1瓶（7mL）；酶標二抗溶液：1瓶（7mL）；濃縮洗滌液10×：1瓶（30mL）；濃縮樣品復溶液10×：1瓶（20mL）；終止液：1瓶（7mL）；底物溶液A：1瓶（7mL）；底物溶液B：1瓶（7mL）；封板膜：1張。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取2±0.05g均質樣品于50mL離心管中，加入1±0.05g中性氧化鋁，6mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5min。室溫4,000r/min離心10min。取1.5mL上清液至10mL離心管中，60℃下氮氣吹干。殘留物先加入1mL 1×樣本復溶液再加入1mL正己烷，渦旋振蕩10s。室溫4,000r/min離心10min，取下層水相進行檢測分析。

1.2.2 樣品測定

將磺胺類藥物標準品和待測樣品對應微孔按序編號，每個標準品和待測樣品均做重復孔。

每孔加入標準品溶液或樣品提取液50μL，然后先后每孔加入酶標二抗溶液50μL和抗體工作液50μL。

輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于25℃避光反應30min。

小心揭開封板膜，將孔內液體甩干，每孔加入1×洗滌液250μL洗滌微孔板，連續洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

將底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，振蕩混勻，每孔加入100μL，25℃避光顯色15min。

每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，5min內測定450nm處吸光度值。

1.2.3 標準曲線的制作及樣品濃度的計算

所獲得的標準品溶液、待測樣品、樣品加標吸光值（B）除以0號標準品溶液吸光值（B0）再乘以100%，即為標準品溶液、待測樣品、樣品加標的吸光度比值（%）。以磺胺類藥物標準品溶液濃度的對數值為橫坐標，對應的百分吸光度比值為縱坐標，繪制標準曲線，用回歸方程法，計算出樣品中磺胺類藥物的濃度。由計算所得樣品的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣品中磺胺類藥物的實際濃度。

2 結果與分析

2.1 磺胺類藥物的標準曲線

按照1.2.2步驟，分別測定濃度為0、0.5、1.5、4.5、13.5和40.5μg/L磺胺類藥物標準溶液的吸光度，由計算機系統回歸統計得到在0.5～40.5μg/L范圍內呈線性，磺胺類藥物濃度對數值（x，μg/L）與吸光度比值（y=B/B0，%）的線性方程為y=-37.002x+72.475，相關系數R為0.9982。從圖1可以看出，磺胺類藥物在0.5～40.5μg/L范圍內有良好的線性關系。

2.2 樣品中磺胺類藥物的殘留量

由表1可知，水產品中磺胺類藥物殘留量均小于100μg/ kg，符合國家標準對水產品中磺胺類藥物含量的要求。

2.3 準確度測定

準確度測定結果見表2。

從實驗結果中可以看出：最低回收率為87.5%，最高為104.2%，試劑盒的回收率高。結果表明，該測定方法的精度符合微量分析要求

3 討論與結論

酶聯免疫法是一種將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合發展建立的一種免疫分析方法。與儀器分析技術相比具有快速、簡便、準確和靈敏度高的特點。該試驗的檢出限為4μg/kg，平均回收率為87.5%～104.2%，相對標準偏差（RSD）≤4.32%。且在0.5～40.5μg/L范圍內有良好的線性關系，相關系數為0.9982。

運用該方法進行水產品中磺胺類藥物殘留的檢測，樣品前處理簡單，檢測成本低，檢測結果準確率高，可以用于大批量水產品磺胺類藥物殘留的快速檢測。在現場監控和日常檢測中應用前景非常廣闊。

酶聯免疫法雖然操作簡便，但影響檢測結果的因素也較多，在實驗過程中應注意以下幾點：試劑盒保存于2℃～8℃，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔密封后2℃～8℃存放，并盡快使用，底物溶液要避光保存；使用之前，將樣品及所需試劑的溫度平衡至20℃～25℃，否則可能導致后面檢測吸光度值偏低；若樣品的百分比吸光值（%）超出標準曲線范圍，應使用1×樣品復溶液做適當稀釋后測得；不同批號試劑不能混用；每批次樣品均要進行加標試驗，確保檢測結果的準確性。

酶聯免疫法檢測的影響因素很多，容易出現假陽性結果，因此，它只是檢測水產品中磺胺類藥物殘留的篩選測定方法，陽性樣品再用高效液相色譜法或氣質聯用法檢測，獲得準確的檢測結果。（參考文獻略）