鏈球菌噬菌體的分離及其研究

■ 秦生巨戚太海張連水羅霞

（1南京巨豹生物工程有限公司 2滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司 3中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所）

鏈球菌噬菌體的分離及其研究

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（1南京巨豹生物工程有限公司 2滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司 3中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所）

噬菌體是一類細(xì)菌特異性的病毒，它有典型的病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)。噬菌體對(duì)宿主有高度的特異性。噬菌體的作用方式，是以尾鞘吸附到宿主細(xì)胞特定的受點(diǎn)上，向菌體內(nèi)注射RNA，并在菌體內(nèi)復(fù)制子代，最終溶解宿主的方式，釋放子代。噬菌體不能在停止新陳代謝的宿主內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。

羅非魚，是世界水產(chǎn)業(yè)的重點(diǎn)科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類，且被譽(yù)為未來(lái)動(dòng)物性蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一。通常生活于淡水中，也能生活于不同鹽份含量的咸水中，也可以存活于湖，河，池塘的淺水中。它有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，在面積狹小之水域中亦能繁殖，甚至在水稻田里能夠生長(zhǎng)，且對(duì)溶氧較少之水有極強(qiáng)之適應(yīng)性。絕大部分羅非魚是雜食性，常吃水中植物和碎物。

鏈球菌是化膿性球菌的另一類常見的細(xì)菌，廣泛存在于自然界和人及動(dòng)物糞便，健康人鼻咽部，大多數(shù)不致病。醫(yī)學(xué)上重要的鏈球菌主要有化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌等。引起人類的疾病主要有化膿性炎癥、毒素性疾病和超敏反應(yīng)性疾病等。

羅非魚鏈球菌病是2009年發(fā)生在廣東、廣西、海南3省的一種魚類疾病。網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖的羅非魚均有此病的發(fā)生，主要危害親魚和100g以上的幼魚和成魚；流行高發(fā)期為5～9月份；流行水溫為25℃～37℃，在水溫32℃以上容易發(fā)病，且傳染性強(qiáng)，發(fā)病率達(dá)20%～30%，發(fā)病魚的死亡率可達(dá)80%以上。

表1 不同溫度對(duì)鏈球菌噬菌體形成噬菌斑活力的影響

表2 3株噬菌體于不同來(lái)源的鏈球菌株上形成噬菌斑能力的測(cè)定

表3 不同保存方法對(duì)噬菌體HN48/SS130920存活時(shí)間的影響

近年來(lái)國(guó)內(nèi)許多同行都在探索羅非魚鏈球菌病的防治方法，但國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)用噬菌體防治羅非魚鏈球菌病的報(bào)導(dǎo)。2015年我們?cè)诤Ｄ鲜∽隽肆_非魚養(yǎng)殖水體及羅非魚體內(nèi)鏈球菌噬菌體的分離檢測(cè)。本文是對(duì)此次分離、純化的鏈球菌噬菌體的初步研究結(jié)果的報(bào)導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

胨肉膏液：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，加蒸餾水到1,000mL，調(diào)整pH到7.4。固體培養(yǎng)基：上述胨肉膏液加1.2%瓊脂粉。半固體培養(yǎng)基：上述胨肉膏液加0.7%瓊脂粉。軟瓊脂培養(yǎng)基：上述胨肉膏液加0.3%瓊脂粉。0.85%生理鹽水：NaCl8.5g，加蒸餾水到1,000mL，調(diào)整pH到7.4。

1.2 宿主菌株

用于檢查、分離、培養(yǎng)鏈球菌噬菌體及其檢查其宿主范圍的鏈球菌株為本公司及中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所保存者。

1.3 檢測(cè)樣本

用于檢測(cè)的水體和羅非魚樣本來(lái)自海南省海口市郊區(qū)桂林洋和文昌市大致坡。

1.4 噬菌體噬菌斑的檢測(cè)、計(jì)數(shù)

幼稚宿主菌懸液的制備：將保存獲得的鏈球菌在胨肉膏固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，于37℃培養(yǎng)18～24h，取典型的菌落圖片，革蘭氏染色鏡檢，可見典型的鏈球菌形態(tài)。取典型的菌落接種到胨肉膏液中，于37℃培養(yǎng)4～6h備用。雙層瓊脂法。

1.5 鏈球菌噬菌體的檢出、分離、純化與培養(yǎng)

采集的新鮮水樣450mL，加10倍濃縮的胨肉膏液50mL，加幼稚宿主菌懸液2mL于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。采集的羅非魚樣品取其魚的內(nèi)臟10～15g加到500mL的胨肉膏液中，同時(shí)加2mL幼稚宿主菌懸液，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取培養(yǎng)過(guò)夜的樣品上清液10mL，12,000prm取上清液，于56℃水浴培養(yǎng)1h，取上清液0.5mL以鏈球菌幼稚菌懸液0.2mL為宿主，用雙層瓊脂平板法檢查噬菌斑的形成。有透明的噬菌斑的形成即可判定有噬菌體的檢出為陽(yáng)性，未見有透明的噬菌斑的形成即可判定噬菌體的檢出為陰性。分離、純化、培養(yǎng)。

1.6 鏈球菌噬菌體的保存

圖1 噬菌斑

將分離獲得的噬菌體H N 4 8/SS130920制成上清液，用以下不同的方法和條件保存。

胨肉膏液：于100mL胨肉膏液中加噬菌體上清液2mL；軟瓊脂：于10mL胨肉膏軟瓊脂中加噬菌體上清液0.5mL；半固體瓊脂：于10mL胨肉膏半固體瓊脂中加噬菌體上清液0.5mL；于自來(lái)水液中加含量大約為105/pfu噬菌體。以上4種方法都同時(shí)平行做2組，一組加鏈球菌幼稚菌液，使其濃度大約為106/cfu。另一組不加鏈球菌幼稚菌液。4種方法每組做3管。然后加有鏈球菌幼稚菌液和不加鏈球菌幼稚菌液的保藏物，分別放置于4℃、37℃及室溫（南京市的2015年9月到2016年8月）保存，并檢查存活時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的檢出、分離結(jié)果及菌株的檢查

2015年7～9月及2016年9～10月于海南省文昌市和海口市6處采集海、淡水樣79份，羅非魚樣品3份，共計(jì)82份樣品。其中檢出在鏈球菌宿主上能形成噬菌斑的5份（3.79%），其中淡水檢查3份，海水2份，羅非魚樣品沒有檢出噬菌斑。有5份陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)噬菌斑純化得到3株（HN48/SS130920、HN58/SS130920、HN74/SS130920、）無(wú)雜菌生長(zhǎng)的噬菌體株，對(duì)其進(jìn)一步檢查。

其結(jié)果為：在胨肉膏雙層瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)12～18小時(shí)形成透明的噬菌斑，噬菌斑的直徑1～3mm（見圖1）；可使?jié)夂竦乃拗骶巳飧鄳乙海?0億/mL）4～6h后裂解透明。

2.2 溫度對(duì)噬菌斑形成的影響

檢查了不同溫度對(duì)3株噬菌體于胨肉膏雙層瓊脂培養(yǎng)基平板上形成噬菌斑活力的影響，25℃～40℃16h均可形成噬菌斑。但從已形成噬菌斑活力來(lái)看35℃更為合適，20℃及以下、45℃及以上未見噬菌斑的形成。結(jié)果見表1。

2.3 于不同的鏈球菌株上形成噬菌斑能力的測(cè)定

檢查了3株噬菌體于胨肉膏雙層瓊脂培養(yǎng)基平板上對(duì)不同來(lái)源的鏈球菌形成噬菌斑的能力（宿主范圍）。每平板接種噬菌體上清液0.5mL，鏈球菌宿主菌幼稚培養(yǎng)液0.2mL，37℃培養(yǎng)16h觀察結(jié)果。結(jié)果見表2。

2.4 保存方法及存活時(shí)間

檢查了噬菌體HN48/SS130920在胨肉膏液、軟瓊脂、半固體瓊脂、自來(lái)水中的存活時(shí)間；同時(shí)檢查了加有宿主鏈球菌幼稚菌液和不加宿主鏈球菌幼稚菌液對(duì)其保存的影響；也觀察了在4℃、37℃及室溫（南京市的2015年9月到2016年8月）鏈球菌噬菌體存活時(shí)間。結(jié)果見表3。

3 討論

根據(jù)噬菌體株的特性這是一類以鏈球菌為宿主的鏈球菌噬菌體。據(jù)此次調(diào)查，養(yǎng)殖羅非魚的海、淡水體都可分離到此類噬菌體的存在，但含量有限。

噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。在人和動(dòng)物的排泄物或污染的井水、河水中，常含有噬菌體。鏈球菌噬菌體在污染的水源中也不難找到其宿主，尤其是水生物的養(yǎng)殖水源中。25℃～40℃都有裂解活力。在加有宿主菌的胨肉膏液中4℃環(huán)境中保存1年以上仍可檢出。因此推測(cè)在自然環(huán)境水體中將可繁衍生存。其存在對(duì)鏈球菌，尤其是羅非魚鏈球菌病的病原菌在自然界的生物控制中所起的作用值得進(jìn)一步探討。（參考文獻(xiàn)略）