結締組織生長因子對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響

丁　爽,方　芳,段宏梅,吳春玲,劉海娜,肖衛國

(中國醫科大學附屬第一醫院風濕免疫科,沈陽110001)

結締組織生長因子對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響

丁爽,方芳,段宏梅,吳春玲,劉海娜,肖衛國

(中國醫科大學附屬第一醫院風濕免疫科,沈陽110001)

目的觀察結締組織生長因子(CTGF)對體外培養的類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞(FLS)增殖的影響,探索CTGF在類風濕關節炎滑膜病變中的可能作用機制.方法體外培養FLS并用免疫組化法鑒定.加入不同濃度的外源性CTGF[0 ng/ mL(對照組),5,10,25,50 ng/mL],用3H-TdR摻入法檢測對FLS增殖的影響.特異性細胞信號通路阻斷劑預處理后,探討CTGF對FLS作用的可能機制.結果體外培養FLS,經光鏡觀察及免疫組化鑒定符合成纖維樣滑膜細胞特征.CTGF 10,25,50 ng/ mL組細胞增殖隨CTGF濃度上升而增加,且與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01);但CTGF 25 ng/mL組與50 ng/mL組間差異無統計學意義(P>0.05).特異性的信號通路阻斷劑分別阻斷NF-κB信號通路、PI-3激酶信號通路、p38 MAPK信號通路和ERK-1/2信號通路,只有PD98059組FLS增殖較CTGF 25 ng/mL組有明顯差異(P<0.05).結論外源性CTGF可以促進體外培養的FLS增殖,并且在一定濃度范圍內呈現濃度依賴性.這種促進增殖的作用很可能是通過活化ERK-1/2信號通路完成的.

結締組織生長因子;成纖維樣滑膜細胞;增殖

網絡出版地址

類風濕關節炎(rheujnatoid arthritis,RA)是一種常見的以關節滑膜慢性炎性病變為主要表現的自身免疫性疾病,其病理特征主要表現為滑膜組織異常增生、炎性細胞浸潤、新生微血管形成.研究[1]表明,RA患者滑膜襯里層有4～10層細胞,是正常人關節滑膜襯里層細胞的4～5倍,滑膜細胞的異常增生形成了類似腫瘤樣結構的血管翳,侵蝕軟骨與骨,最終導致了關節破壞.目前認為滑膜細胞增生與滑膜細胞的增殖、凋亡失衡有關,其中成纖維樣滑膜細胞(fibrob1ast-1ike synoviocytes,FLS)被認為是引起滑膜增生的主要細胞.FLS分泌高水平促炎性細胞因子、化學趨化因子、基質蛋白降解酶等,持續刺激滑膜細胞,作用于滑膜信號轉導途徑的不同部位,引起細胞內蛋白激酶的持續激活,導致滑膜信號轉導異常以及滑膜細胞的增殖與凋亡失衡[2],引起關節的炎癥和破壞.

在病理情況下,結締組織生長因子(connectivetissue growth factor,CTGF)特異性地在間充質來源的細胞中高表達,參與多種增生性或纖維化性疾病的發生、發展.有研究表明它具有促進細胞增殖[3],促進膠原合成、調節細胞外基質基因的表達[3],促進細胞表型轉化等生物學效應[4].

本研究在對外源性CTGF刺激FLS增殖進行觀察的同時,以特異性信號分子阻斷劑作為干預手段,探討CTGF促FLS增殖的信號轉導機制,為進一步揭示CTGF在RA滑膜病變時中的作用機制提供實驗依據.

1　材料與方法

1.1組織標本與試劑

組織標本取材于中國醫科大學附屬第一醫院骨科,經關節鏡滑膜切除術后的3例RA患者滑膜組織,患者的診斷均符合1987年美國風濕病學會(ARA)修訂的RA的診斷標準.所有標本取得均獲得受試者知情同意.試劑主要包括:重組人CTGF (rhCTGF,PeProtechEC公司),3H-胸腺嘧啶核苷(3HTdR,中國原子能科學研究院),胎牛血清(FCS)、DEME(高糖)培養基(Hye1one公司),胰蛋白酶、膠原酶Ⅲ、EDTA(Difco公司),SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司),DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司),PDTC、LY294002、SB203580、PD98059(碧云天生物技術研究所).

1.2方法

1.2.1RA FLS分離和培養:無菌獲取滑膜組織,盡量剔除脂肪及纖維組織,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～3遍,去除血污,反復剪切成約1 mmX1 mmX1 mm的細小組織塊,置于無菌培養皿中,加入膠原酶Ⅲ(2 mg/mL)37℃消化2～4 h,200目紗網過濾后,離心,去除脂肪及雜質,加入達氏修正液(DMEM),分裝于培養瓶內,置于37℃5%CO2孵箱內培養24 h后更換培養液,待滑膜細胞80%匯合成片,消化傳代,實驗用3～7代細胞.

1.2.2FLS鑒別:將細胞懸液加入24孔板內(孔內預先置直徑10 mm的圓玻片),密度為2X104/mL,培養箱中培養48 h,棄上清,甲醇-20℃固定15 min.洗滌圓玻片,待干燥后用于免疫組織化學.滴加一抗鼠抗人Vimentin單克隆抗體及鼠抗人CD68單克隆抗體,置濕盒內4℃孵育過夜,并設空白對照組(無一抗,加PBS).PBS振洗3 minX3次,滴加生物素羊抗鼠IgG,37℃孵育20 min,PBS振洗3 minX3次,滴加SP,37℃孵育20 min,PBS振洗3 minX3次,DAB顯色,蘇木素復染,明膠甘油封片劑封片,倒置顯微鏡下觀察照相.

1.2.3FLS增殖實驗:3H-TdR摻人法測定DNA合成.傳代細胞以2X103/孔接種于96孔板,每孔加200 μL含10%FBS的DMEM培養液,37℃、5%CO2培養箱孵育12 h后棄培養基,用含rhCTGF終濃度分別為0 ng/mL(對照組),5,10,25,50 ng/mL的10% FBS-DMEM繼續培養24 h,將3H-TdR(1 μCi/孔)加入培養液,繼續培養18 h.然后用質量濃度為2.5%的胰蛋白酶消化并轉移至玻璃纖維濾紙上,依次用等滲鹽水,體積分數10%的三氯醋酸、無水乙醇沖洗、固定,干燥后加閃爍液,用Beckman液體閃爍液, β計數儀檢測每分鐘計數(counts per minute,CPM)值.

1.2.4信號通路阻斷實驗:傳代細胞以2X103/孔接種于96孔板,每孔加200 μL含10%FBS的DMEM培養液,37℃、5%CO2培養箱孵育12 h后棄培養基,分別加入4 μmo1/L PDTC(NF-κB信號通路阻斷劑, PDTC組)、20 μmo1/L LY294002(PI-3激酶信號通路阻斷劑,LY294002組)、10 μmo1/L SB203580(p38 MAPK信號通路阻斷劑,SB203580組)、1 μmo1/L PD98059(ERK-1/2信號通路阻斷劑,PD98059組) 30 min后,加入濃度為25 ng/mL的rhCTGF,作用24 h,3H-TdR摻人法檢測細胞增殖.

1.3統計學分析

采用Graphpad prism 5.0進行作圖和分析.計量資料以±s表示,2組計量資料的比較采用t檢驗,多組之間計量資料的比較采用one-way ANOVA法,多組之間的兩兩比較采用Bonferroni法.P< 0.05為差異有統計學意義.

2　結果

2.1光鏡下觀察RA FLS形態

光鏡下觀察RA FLS可見細胞形態成長梭形,排列較為不規則,符合成纖維樣細胞的形態學特點.見圖1、圖2.

2.2RA FLS鑒定

免疫組化染色后顯微鏡下觀察細胞,可見RA FLS胞質內抗vimentin抗體陽性,見圖3.免疫組化染色后顯微鏡下觀察細胞,可見RA FLS胞質內抗CD68抗體陰性,見圖4.抗vimentin抗體陽性及抗CD68抗體陰性,符合FLS的特征.

2.3CTGF對FLS增殖的影響

結果顯示,對照組,CTGF 5、10、25、50 ng/mL各濃度組3H-TdR摻入值(CPM/孔)分別為1 969.7± 62.0、2 143.7±117.9、3 630.7±351.9、5 011.0±351.6、5 510.0±738.0.CTGF10、25、50 ng/mL各組細胞增殖隨CTGF濃度上升而增加,且與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01);但25 ng/mL與50 ng/mL CTGF組間差異無統計學意義(P>0.05).提示CTGF能夠刺激FLS增殖,并且在一定濃度范圍內呈現濃度依賴性.

2.4CTGF促進FLS增殖的信號傳導途徑

在25 ng/mL CTGF刺激FLS 24 h后(CTGF組) CPM達4 911±301.1,而對照組為2 047±247.7,2者差異具有統計學意義(P<0.01).在25 ng/m L CTGF刺激前分別加入4 μmo1/L PDTC(PDTC組)、20 μ mo1/L LY2940029(LY2940029組)、10 μ mo1/L SB203580(SB203580組),1 μ mo1/L PD98059 (PD98059)進行預處理后各組的CPM分別為4 058± 521.2、4 107±553.8、3 733±760.2、3 142±395.9.與CTGF組比較,PD98059組CPM差異具有統計學意義(P<0.05);而PDTC組、LY2940029組、SB203580組與CTGF組比較差異均無統計學意義(P>0.05),提示CTGF可能通過ERK-1/2信號通路的活化發揮促進FLS增殖的作用.

3　討論

炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、血管翳形成,最終侵蝕軟骨及軟骨下骨,造成關節破壞和畸形為RA發病的主要病理特征.控制關節局部的滑膜病變已成為改變RA預后的關鍵環節之一.RA患者的滑膜襯里層通常有2種主要的細胞類型,分別為A型細胞(巨噬細胞樣細胞)和B型細胞(成纖維樣細胞),前者來自于骨髓的單核/巨噬細胞,后者主要來源于局部細胞的增殖.這些細胞不僅在數量上異常增多,而且在功能上處于異常活躍狀態,它們可以表達多種黏附分子、促炎性細胞因子、趨化因子,促進炎性反應的發生和血管翳的形成[2],同時還可產生多種蛋白酶,降解細胞外基質成分和軟骨蛋白多糖,導致軟骨和骨組織結構破壞.因此阻止滑膜細胞的增生和活化對控制RA的發病和病情進展有重要的意義[1].

CTGF是一種富含半胱氨酸的生長調節因子,是CCN蛋白家族成員之一.近年來的研究[5,6]顯示CTGF成為一種新型的炎性調節因子.Wang等[7]發現CTGF能夠調節RA患者基質金屬蛋白酶(matrixmeta11oproteinase,MMP)的表達.Nozawa等[8]的研究表明拮抗CTGF能夠阻止大鼠膠原蛋白誘導性關節炎的發展.我們在較早的研究[9]中發現RA患者的血清CTGF水平高于健康對照組,且在病情高度活動的RA患者血清中的CTGF水平明顯高于疾病中低度活動組.以上研究結果提示CTGF可能參與了RA的發生和發展.有文獻[10]報道CTGF能促進體外培養的皮膚和角膜成纖維細胞的增生.

圖1　光鏡下觀察RA FLS x100Fig.1 RA FLS observed under light m icroscope x100

圖2　光鏡下觀察RA FLS x200Fig.2 RA FLS observed unde r light m icroscope x200

圖3　FLS胞質vim entin(+)X 400Fig.3 Vimentin staining in FLS endochylema(+)X 400

圖4　FLS胞質CD68(-)X 400Fig.4 CD68 sta ining in FLS endochylema(-)X 400

我們預實驗已經發現RA患者關節滑液中的CTGF濃度大約在10～40 ng/mL,因此我們選擇0～50 ng/mL的濃度范圍進行增殖實驗.在本次研究中我們通過3H-TdR摻人實驗證實了外源性CTGF對RA FLS的促增殖作用,發現5 ng/mL CTGF對FLS無明顯促進增殖的作用;10、25、50 ng/mL CTGF組細胞增殖隨CTGF濃度上升而增加,與對照組比較有統計學差異(P<0.05);而25 ng/m L與50 ng/mL CTGF組間比較無統計學差異(P>0.05).提示這種促增殖效應在一定范圍內有劑量依賴性.

細胞內信號轉導通路間存著復雜的交叉對話,細胞增殖可能與多條信號通路的活化有關.為了探討CTGF促進FLS增殖的具體機制,筆者用特異性的信號通路阻斷劑PDTC、LY294002、SB203580、PD98059分別阻斷NF-κB信號通路、PI-3激酶信號通路、p38 MAPK信號通路和ERK-1/2信號通路,結果發現只有PD98059組FLS增殖較CTGF組有明顯差異(P<0.05),提示CTGF很可能是通過ERK-1/2信號通路的活化發揮促進FLS增殖的作用.這與以往CTGF通過ERK1/2信號通路促進皮膚和角膜成纖維細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞及腎小球系膜細胞增殖的報道一致[10,11],提示CTGF可能具有促間充質來源細胞增殖的共性.

關于滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關基因的關系已有研究報道[12～14],本研究結果顯示CTGF蛋白介導RA滑膜增殖、促進FLS增殖的作用很可能是通過ERK-1/2信號通路活化實現的.但關于CTGF如何促進滑膜細胞增殖及其調控機制尚待進一步研究.

[1]Coo1es FA,Isaacs JD.Pathophysio1ogy of rheumatoid arthritis[J]. Curr Opin Rheumato1,2011,23(3):233-240.

[2]Bartok B,Firestein GS.Fibrob1ast-1ike synoviocytes:key effector ce11s in rheumatoid arthritis[J].Immuno1 Rev,2010,233(1): 233-255.

[3]Jun JI,Lau LF.Taking aim at the extrace11u1ar matrix:CCN proteins as emerging therapeutic targets[J].Nat Rev Drug Discov,2011,10 (12):945-963.

[4]Katsube K,Sakamoto K,Tamamura Y,et a1.Ro1e of CCN,avertebrate specific gene fami1y,in deve1opment[J].Dev Growth Differ, 2009,51(1):55-67.

[5]Ku1ar L,Pakradouni J,Kitabgi P,et a1.The CCN fami1y:a newc1ass of inf1ammation modu1ators[J].Biochimie,2011,93(3):377-388.

[6]Charrier A,Chen R,Kemper S,et a1.Regu1ation of pancreaticinf1ammation by connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)[J]. Immuno1ogy,2014,141(4):564-576.

[7]Wang JG,Ruan J,Li CY,et a1.Connective tissue growth factor,aregu1ator re1ated with 10-hydroxy-2-decenoic acid down-regu1ate MMPs in rheumatoid arthritis[J].Rheumato1 Int,2012,32(9): 2791-2799.

[8]Nozawa K,Fujishiro M,Kawasaki M,et a1.Inhibition of connectivetissue growth factor ame1iorates disease in a murine mode1 of rheumatoidarthritis[J].Arthritis Rheum,2013,65(6):1477-1486.

[9]丁爽,段宏梅,方芳,等.類風濕性關節炎患者血清中結締組織生長因子水平分析[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(1): 97-99.

[10]Radhakrishnan SS,B1a1ock TD,Robinson PM,et a1.Effect of connectivetissue growth factor on protein kinase expression and activity in humancornea1 fibrob1asts[J].Invest Ophtha1mo1 Vis Sci, 2012,53(13):8076-8085.

[11]Huang HC,Yang M,Li JZ,et a1.Connective tissue growth factor promotes the pro1iferation of myofibrob1ast through Erk-1/2 signa1-ing pathway[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2005,85(19): 1322-1326.

[12]Sano H,Eng1eka K,Mathern P,et a1.Coexpression of phosphotyrosine-containing proteins,p1ate1et derived growth factor-B,and fibrob1ast growth factor-1 in situ in synovia1 tissues of patients with rheumatoid arthritis and Lewis rats with ad juvant or streptococca1 ce11 wa11 arthritis[J].J C1in Invest,1993,91(2):553-565.

[13]Shiozawa S,Shiozawa K,Tanaka Y,et a1.Human epiderma1 growth factor for the stratification of synovia1 1ining 1ayer and neovascu1arisation in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis,1989,48(10): 820-828.

[14]Fire A,Xu S,Montgomery MK,et a1.Potent and specific genetic interference by doub1e-stranded RNA in caenorhabditis e1egans[J]. Nature,1998,391(2):806-811.

(編輯武玉欣)

EffectofConnective TissueGrow th Factor on Proliferation of Fibroblast-likeSynoviocytesof Rheumatoid Arthritis

DINGShuang,FANGFang,DUANHong-mei,WUChun-1ing,LIUHai-na,XIAOWei-guo
(DepartmentofRheumato1ogyand Immuno1ogy,The FirstHospita1,ChinaMedica1University,Shenyang110001,China)

Objective To investigate the in vitroeffectofconnectivetissuegrowth factor(CTGF)on thepro1iferationof fibrob1ast-1ikesynoviocytes (FLS)of rheumatoid arthritis(RA),and exp1ore the potentia1 signa1 transduction mechanisms of CTGF-induced FLS pro1iferation.Methods FLS were cu1tured in vitro and identified by immunohistochemica1 method.FLS pro1iferation was measured by thymidine incorporation after exogenous CTGF stimu1ation with different concentrations(0,5,10,25,50 ng/mL).After specific ce11u1ar signa1ing pathway b1ockers pretreatment of cu1tured FLS,observe theeffectsofCTGFon FLSpro1iferation by thymidine incorporation.Results Ce11scu1tured in vitrowere comp1iedwith the FLScharacteristics by optica1 microscopy and immunohistochemica1 identification.The pro1iferation of FLS was gradua11y increased as the concentration of CTGF e1evating from 10 ng/mL to 50 ng/mL,which were significant1y higher than the contro1 group(P<0.01).However,no significant difference was observed between FLS cu1tured with 25 ng/mL CTGF and those cu1tured with 50 ng/mL CTGF(P>0.05).Inhibition of ERK-1/2 by PD98059 significant1y suppressed CTGF-mediated FLS pro1iferation(P<0.05).Conclusion CTGF induced a pro1iferative response in FLS,and this action is1ike1ydependenton theactivationofERK-1/2signa1pathway.

connective tissue growth factor;fibrob1ast-1ike synoviocytes;pro1iferation

R593.22

A

0258-4646(2016)03-0205-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.004

遼寧省醫學高峰建設工程專項經費項目任務實施方案(2010006)

丁爽(1981-),女,講師,博士.

肖衛國,E-mai1:XOnet5670@163.com

2015-10-19

網絡出版時間: