姜黃素在缺氧致視網膜神經節細胞氧化應激損傷中的作用及機制

裴　涌,郝旭紅,孫曉楠

(沈陽市第四人民醫院眼科,沈陽110031)

姜黃素在缺氧致視網膜神經節細胞氧化應激損傷中的作用及機制

裴涌,郝旭紅,孫曉楠

(沈陽市第四人民醫院眼科,沈陽110031)

目的觀察姜黃素對缺氧致小鼠視網膜神經節細胞RGC-5氧化應激損傷的影響,并探討其作用機制.方法以小鼠RGC-5細胞株為研究對象,按照不同處理因素將細胞隨機分為4組:正常對照組、缺氧組、缺氧+溶劑(二甲基亞砜)對照組、缺氧+姜黃素預處理組.2′7′-二氯熒光素探針法檢測細胞內活性氧自由基(ROS),四甲基偶氮唑藍法檢測細胞增殖活性,Western b1ot檢測細胞內核轉錄因子Nrf2蛋白的表達,實時熒光定量RT-PCR檢測醌氧化還原酶(NQO1)和血紅素氧合酶1(HO-1)mRNA表達.結果與正常對照組相比,缺氧組細胞內ROS含量明顯增高(P<0.05),細胞活性明顯降低(P<0.05);而缺氧+姜黃素預處理組缺氧導致的細胞氧化應激損傷明顯減輕,并且細胞內的Nrf2蛋白水平明顯增加(P<0.05),NQO1和HO-1mRNA表達明顯提高(P<0.05).結論姜黃素能夠激活視網膜神經節細胞內Nrf2抗氧化通路,上調其介導的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因NQO1和HO-1的轉錄活性,從而減輕缺氧導致的視網膜神經節細胞氧化應激損傷.

姜黃素;缺氧;視網膜神經節細胞;核轉錄因子Nrf2;氧化應激

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視網膜神經節細胞(retina1 gang1ion ce11,RGC)是視網膜最終端的神經元,在視覺信息的整合和傳遞中至關重要.缺血、缺氧誘發氧化應激導致RGC損傷、變性和凋亡,最終引起視覺功能喪失.姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術等的塊莖中提取出來的一種酚性色素,醫學研究表明其具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等作用,但具體機制還不十分清楚.本研究建立了RGC-5缺氧模型,觀察姜黃素對缺氧導致的RGC-5氧化應激損傷的影響,并探討其作用機制,為預防和治療RGC缺血、缺氧損傷提供實驗依據.

1　材料與方法

1.1材料

小鼠RGC-5細胞株,購自美國ATCC細胞庫.姜黃素、二甲基亞砜(dimethy1 su1foxide,DMSO)、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針(DCFH-DA)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、堿性磷酸酶標記的抗兔IgG和抗小鼠IgG,購自美國Sigma公司;胎牛血清、DMEM、Trizo1,購自美國Invitrogen公司;Nrf2、β-actin一抗,購自美國Santa Cruz公司;逆轉錄試劑盒及PCR擴增試劑盒,購自美國App1ied Biosystem公司.

1.2方法

1.2.1細胞培養及實驗分組:用DMEM培養基(含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素100 U/mL),在37℃、5%CO2孵育箱內培養小鼠RGC-5細胞株,3～4 d傳代1次.將細胞隨機分為4組:正常對照組、缺氧組、缺氧+溶劑(DMSO)對照組、缺氧+姜黃素預處理組,其中缺氧+溶劑對照組是為了排除DMSO的干擾因素.缺氧模式將培養基更換為經缺氧處理(預先用氮氣飽和)的無糖、無血清培養基,然后放入37℃、95%N2、5%CO2三氣培養箱中6 h,之后更換含糖、含血清培養基,置于37℃、5%CO2孵育箱內繼續培養4 h.缺氧+溶劑對照組和缺氧+姜黃素預處理組分別先給予含0.01%DMSO或10 μmo1/L姜黃素(用終濃度為0.01%DMSO配制)的培養基預處理6 h,再按上述給予缺氧處理.

1.2.2細胞內活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量測定:將細胞濃度調整為1X106個,加入終濃度10 μmo1/L的DCFH-DA,避光孵育30 min.PBS洗滌細胞3次,流式細胞儀檢測熒光強度(激發波長485 nm,發射波長530 nm),以熒光強度反映細胞內ROS含量.

1.2.3細胞增殖活性測定:取各組細胞制成單細胞懸液,以5X103/孔接種到96孔細胞培養板中.培養24 h后,按上述各分組處理方法處理細胞后,終止培養.每孔加入MTT 20 μL(濃度為5 g/L),繼續避光培養4 h,終止培養,小心棄上清,加入200 μL DMSO溶解MTT,在酶聯免疫檢測儀上測定波長為490 nm處各孔的吸光度.

1.2.4Western b1ot檢測Nrf2蛋白表達:收集各組細胞,RIPA裂解液裂解細胞,離心收集上清.應用BSA方法測定蛋白濃度.選擇4%～12%Tris-G1ycine凝膠進行電泳,轉膜并加入Nrf2(1∶200)、β-actin (1∶1 000)一抗.二抗為堿性磷酸酶標記的抗兔IgG(1∶1 000)、抗小鼠IgG(1∶1 000).加入ECF底物進行熒光顯色.采用Image J分析灰度值,以βactin作為內參照.

1.2.5實時熒光定量RT-PCR檢測醌氧化還原酶[NAD(P)H quinone oxidoreduetase,NQO1]和血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)mRNA的表達:提取細胞總mRNA,按逆轉錄試劑盒說明書進行RNA逆轉錄反應合成cDNA.然后進行實時熒光定量PCR.所用引物序列:NQO1上游5′-TATCCTTCCG AGTCATCTCTAGCA-3′,下游5′-TCTGCAGCTTCC AGCTTCTTG-3′;HO-1上游5′-CCTCACTGGCAGG AAATCATC-3′,下游5′-CCTCGTGGAGACGCTTTAC ATA-3′;內參18S上游5′-CGAACGTCTGCCCTATC AACTT-3′,下游5′-CCGGAATCGAACCCTGATT-3′.由PCR曲線得到到達閾值時的循環數(cyc1e thresho1d,Ct)值,采用2-△△Ct方法進行相對定量分析.

1.3統計學分析

應用Graphpad Prism 5統計軟件進行統計學分析.所有數據用±s表示.組間單比較采用單因素方差分析.P<0.05為差異有統計學意義.

2　結果

2.1細胞內ROS測定結果

與正常對照組相比,缺氧組細胞內ROS含量明顯升高(P<0.05);缺氧+姜黃素預處理組與正常對照組相比細胞內ROS含量升高(P<0.05),但較缺氧組相比明顯降低(P<0.05).缺氧+溶劑對照組與缺氧組比較,細胞內ROS生成無統計學差異.見表1.

表1　4組RGC?5細胞內ROS含量、細胞增殖活性、Nrf2蛋白、NQO1和HO?1 m RNA的表達Tab.1 Dete rm ination of ROS,cell viability,Nrf2 protein,NQO 1 and HO?1 mRNA of the re tinal ganglion cells in 4 groups

2.2細胞增殖活性的測定結果

與正常對照組相比,缺氧組細胞增殖活性明顯降低(P<0.05);缺氧+姜黃素預處理組與正常對照組相比細胞增殖活性亦降低(P<0.05),但較缺氧組細胞增殖活性明顯升高,差異有統計學意義(P< 0.05);缺氧+溶劑對照組與缺氧組比較,細胞活性無統計學差異.見表1.

2.3Western b1ot結果

Nrf2蛋白分子量約為100 000,β-actin分子量約為42 000.缺氧組RGC-5中Nrf2蛋白表達較正常對照組明顯升高(P<0.05);缺氧+姜黃素預處理組Nrf2蛋白表達較缺氧組升高,差異有統計學意義(P<0.05).見圖1,表1.

圖1　4組RGC?5中Nrf2蛋白表達的W estern blo t結果Fig.1 Nrf2 protein expressions of the retinal ganglion ce lls in 4 groups

2.4實時熒光定量RT-PCR結果

缺氧組RGC-5中的NQO1和HO-1mRNA表達較正常對照組明顯增加(P<0.05),而缺氧+姜黃素預處理組NQO1和HO-1mRNA表達較缺氧組升高,差異有統計學意義(P<0.05).見表1.

3　討論

RGC是位于視網膜最終段的神經細胞,其軸索為視神經纖維.視網膜缺血、缺氧誘發的氧化應激,導致RGC進行性死亡,是許多視網膜和視神經疾病發展到最后的必經之路,如糖尿病視網膜病變、青光眼、視網膜中央動脈阻塞等[1,2].

姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術等的塊莖中提取出來的一種酚性色素,是聯合國世界衛生組織/食品藥品管理局批準的天然食品添加劑,在食品生產中主要用于腸類制品、罐頭、醬鹵制品等產品的著色.醫學研究表明:姜黃素有抗氧化、抗炎、抗凝、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、消除自由基及抑制腫瘤生長等多種藥理作用[3～5],但具體作用機制還有待研究.Nrf2抗氧化通路是氧化應激重要的調節途徑,正常情況下Nrf2定位于細胞質中,與其抑制蛋白Keap1結合,當受到來源于ROS的攻擊后Nrf2與Keap1解離,然后轉位進入細胞核,與DNA上一段特異序列抗氧化反應元件結合,介導其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉錄活性,如NQO1和HO-1,增強細胞清除活性氧自由基的能力,降低氧化應激對細胞、組織及器官的損傷[5,6].

本研究建立RGC缺氧模型,檢測細胞內ROS生成、細胞增殖活性的情況.結果發現,RGC經缺氧處理后,細胞內ROS含量明顯增加,細胞活性顯著下降,表明缺氧能誘導氧化應激對RGC造成損傷.而給予姜黃素預處理6 h后能明顯減輕缺氧誘發的細胞內ROS生成和細胞活性損傷,表明姜黃素能增強RGC的抗氧化應激能力,減輕缺氧引發的氧化應激損傷.為了進一步探討姜黃素拮抗RGC氧化應激損傷的機制,我們檢測了各組細胞Nrf2蛋白表達及其下游NQO1和HO-1的基因表達.實驗結果表明,姜黃素的預處理能夠使細胞內Nrf2蛋白及其下游調控的NQO1、HO-1 mRNA的表達增強,并顯著高于單純缺氧組.這些數據表明,姜黃素可以通過活化Nrf2-抗氧化反應元件途徑參與拮抗RGC的氧化應激損傷,也為姜黃素在預防和治療視網膜缺血、缺氧導致的神經節細胞氧化應激損傷提供了可能的治療靶點和途徑.

[1]Cao Y,Li X,Wang CJ,et a1.Ro1e of NF-E2-re1ated factor 2 in neuroprotective effect of 1-carnitine against high g1ucose-induced oxidative stress in the retina1 gang1ion ce11s[J].Biomed Pharmacother, 2015,69:345-348.

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(編輯陳姜)

EffectofCurcum in on Hypoxia-induced OxidativeStress Injury ofRetinalGanglion Cells

PEIYong,HAOXu-hong,SUNXiao-nan
(DepartmentofOphtha1mo1ogy,ShenyangThe FourthHospita1ofPeop1e,Shenyang110031,China)

Objective To investigate the ro1e of curcumin on the hypoxia-induced oxidative stress damages of retina1 gang1ion ce11s and exp1ore the re1ated mechanism.M ethods The retina1 gang1ion ce11s of mouse were divided into 4 groups as fo11ows:contro1 group,hypoxia group,hypoxia+ DMSOgroup,and hypoxia+curcumingroup.The reactiveoxygen species(ROS)in ce11swasmeasured by theDCFH-DA probe.Thece11growth viabi1ity was detected by MTT assay.The protein expression of Nrf2 was determined by Western b1ot.The mRNA expressions of NQO1 and HO-1 were measured by rea1-timeRT-PCR.Results Comparedwith contro1group,thece11u1arROSwasincreasedsignificant1y(P<0.05)and thece11viabi1-ity decreased marked1y(P<0.05)in hypoxia group.Pretreatment with curcumin cou1d marked1y inhibit the hypoxia-induced oxidative stress damages of retina1 gang1ion ce11s.Compared with hypoxia group,curcumin pretreatment cou1d remarkab1y increase the 1eve1 of Nrf2 protein(P<0.05) and a1sothe NQO1 and HO-1mRNA(P<0.05).Conclusion Curcumin pretreatmentcou1d activateNrf2 pathway,and thenup-regu1ate the transcription of the downstream phaseⅡdetoxifying enzymes and antioxidant enzymes,such as NQO1 and HO-1,and fina11y inhibit hypoxia-induced oxidativestressdamagesof retina1gang1ionce11s,

curcumin;hypoxia;retina1 gang1ion ce11s;Nrf2;oxidative stress

R774.1

A

0258-4646(2016)03-0227-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.009

遼寧省自然科學基金(2014020184)

裴涌(1975-),男,副主任醫師,碩士. E-mai1:peiyong75@163.com

2015-09-28

網絡出版時間: