4′，5，7-三羥基異黃酮對LPS誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞ephrinB2及IL-6 mRNA表達(dá)的影響*

姜　念，周雪冰，歐剛衛(wèi)，陸紅玲（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000）

4′，5，7-三羥基異黃酮對LPS誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞ephrinB2及IL-6 mRNA表達(dá)的影響*

姜念，周雪冰，歐剛衛(wèi)，陸紅玲△
（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000）

目的探討4′，5，7-三羥基異黃酮對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）標(biāo)記物ephrinB2及炎癥因子白介素-6（IL-6）mRNA表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)HAEC，分別用濃度為0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL的LPS刺激HAEC 4 h，建立HAEC損傷模型。將培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞分為模型組（LPS 0.1 μg/mL），對照組，4′，5，7-三羥基異黃酮低（1.0 μm/mL）、中（10.0 μm/mL）、高（100.0 μm/mL）濃度組。MTT法檢測細(xì)胞的活力，Real-time PCR法檢測HAEC ephrinB2及IL-6 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果除10.0、100.0 μg/L LPS組外，其余各濃度組與對照組比較，均能使HAEC的活力降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LPS能促進(jìn)ephrinB2及IL-6 mRNA的表達(dá)；4′，5，7-三羥基異黃酮中、高濃度組可促進(jìn)HAEC細(xì)胞活力增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；4′，5，7-三羥基異黃酮低、中濃度組可明顯降低ephrinB2及IL-6 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論適當(dāng)濃度的4′，5，7-三羥基異黃酮對LPS誘導(dǎo)的HAEC損傷有一定的保護(hù)作用。

異黃酮類；內(nèi)皮細(xì)胞；白細(xì)胞介素6；脂多糖類；細(xì)胞增殖；炎癥；ephrinB2

許多研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化（AS）具有變質(zhì)、滲出及增生等炎癥特征，因此，炎癥因子在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷中起著極其重要的作用［1］。其中白介素6（IL-6）在AS中是一種具有較強(qiáng)獨(dú)立預(yù)測價值的炎癥標(biāo)志物，在AS早期階段，IL-6在血管損傷過程中起著重要作用［2-3］。ephrinB2是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物之一，與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、黏附及分化等過程密切相關(guān)，在早期的血管重塑中很重要。4′，5，7-三羥基異黃酮又名染料木素、金雀異黃素，是黃酮類化合物中的一種，已發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血脂及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等生物活性［4-5］，但其具體作用機(jī)制目前仍不十分明了。本研究以脂多糖（LPS）作用人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC），探討4′，5，7-三羥基異黃酮對HAEC ephrinB2 及IL-6mRNA表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步闡明4′，5，7-三羥基異黃酮對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與細(xì)胞株HAEC（美國模式菌種收集中心，即ATCC），4′，5，7-三羥基異黃酮、LPS、胰酶（Hyclone公司），MTT、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS，Gibco公司）。

1.2方法

1.2.1HAEC培養(yǎng)用含1%雙抗、10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HAEC。

1.2.2建立HAEC損傷模型將HAEC傳代培養(yǎng)，生長融合成單層細(xì)胞，采用胰酶消化并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后接種于96孔板（每孔2×104個細(xì)胞），24 h后傾去培養(yǎng)液，用PBS洗 2～3遍。細(xì)胞分組：（1）對照組；（2）不同濃度LPS組：0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μg/mL。刺激各組細(xì)胞4 h，棄培養(yǎng)基后用PBS潤洗2次，加180 μL無血清培養(yǎng)基和20 μL MTT培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基加150 μL DMSO振蕩20 s，于酶標(biāo)儀490 nm處讀取各組OD值。實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3MTT法檢測4′，5，7-三羥基異黃酮對LPS損傷HAEC活力的影響細(xì)胞培養(yǎng)及接種同1.2.1、1.2.2，將細(xì)胞分為對照組、模型組（LPS 0.1 μg/mL）、4′，5，7-三羥基異黃酮低（1.0 μmol/mL，GL）、中（10.0 μmol/mL，GM）、高（100.0 μmol/mL，GH）濃度組。將不同濃度的4′，5，7-三羥基異黃酮與 HAEC孵育 30 min后，加入 LPS （0.1 μg/mL）作用細(xì)胞4 h，棄培養(yǎng)基后用PBS潤洗2次，加180 μL無血清培養(yǎng)基和20 μL MTT培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基加150 μL DMSO振蕩20 s，于酶標(biāo)儀490 nm處讀取各組OD值。實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4Real-time PCR檢測HAEC ephrinB2及IL-6 mRNA的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1、1.2.2。收集各組細(xì)胞，按Trizol試劑盒操作要求提取各組總RNA，按RT-PCR試劑盒操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃15min、85℃5 s、4℃。將擴(kuò)增的cDNA加入至20 μL的反應(yīng)體系。引物序列見表1。

表1　引物序列

PCR采用SYBR GREEN法，反應(yīng)條件：95℃3 min、55℃10 s、60℃30 s，40個循環(huán)，然后65℃5s、95℃5 min。以β-actin作為內(nèi)參基因，目的基因的表達(dá)根據(jù)經(jīng)Real-time PCR儀器檢測的Ct值，通過公式2-（△△Ct）進(jìn)行相對定量分析，計算mRNA表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測不同濃度LPS作用后HAEC活力HAEC經(jīng)不同濃度LPS（0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0μg/mL）刺激4 h后，除10.0、100.0 μg/mL LPS組外，其余各濃度組與對照組比較，均能使HAEC的活力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2MTT法檢測4′，5，7-三羥基異黃酮對LPS損傷HAEC活力的影響模型組OD值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4′，5，7-三羥基異黃酮GM、GH組與模型組比較，反映細(xì)胞存活的OD值有明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2　MTT法檢測不同濃度LPS作用后HAEC活力（±s）

表2　MTT法檢測不同濃度LPS作用后HAEC活力（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別對照組0.1 μg/mL LPS組1.0 μg/mL LPS組10.0 μg/mL LPS組100.0 μg/mL LPS組1 000.0 μg/mL LPS組OD值0.173±0.015 0.117±0.030a0.116±0.024a0.170±0.001 0.138±0.020 0.101±0.012a

表3　MTT法檢測4′，5，7-三羥基異黃酮對HAEC活力的影響（s）

表3　MTT法檢測4′，5，7-三羥基異黃酮對HAEC活力的影響（s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

組別對照組模型組GL（1.0 μmol/mL）GM（10.0 μmol/mL）GH（100.0 μmol/mL）OD值0.479±0.034 0.374±0.059a0.398±0.016 0.447±0.049c0.439±0.006b

2.3Real-time PCR檢測HAEC ephrinB2及IL-6 mRNA的表達(dá)與模型組比較，GL組HAEC ephrinB2 mRNA的表達(dá)降低，GM組對ephrinB2及IL-6 mRNA表達(dá)的抑制作用更明顯，而GH組反而促進(jìn)了HAEC ephrinB2、IL-6 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4及圖1。

表4　ephrinB2及IL-6 mRNA相對表達(dá)情況（±s）

表4　ephrinB2及IL-6 mRNA相對表達(dá)情況（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別對照組模型組GL（1.0 μmol/mL）GM（10.0 μmol/mL）GH（100.0 μmol/mL）ephrinB2 IL-6 1 1 2.509 8±0.253 3 0.886 4±0.101 1a0.067 6±0.001 9b2.815 0±0.388 9a1.360 0±0.226 2 1.224 0±0.220 6 0.985 0±0.049 4a1.650 0±0.155 5a

圖1　ephrinB2及IL-6 mRNA的相對表達(dá)情況

3　討　論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS發(fā)生的早期階段，受損內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)特異性黏附受體及炎性相關(guān)細(xì)胞因子，吸引單核細(xì)胞聚集，黏附于內(nèi)皮，引起慢性炎性反應(yīng)，并不斷攝取已進(jìn)入內(nèi)膜發(fā)生氧化的脂質(zhì)，形成單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，從而引起AS的發(fā)生［6］。LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，在慢性炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。LPS的識別與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是引起細(xì)胞炎癥效應(yīng)的關(guān)鍵，主要通過細(xì)胞膜Toll樣受體4（TLR4）來實(shí)現(xiàn)［7］，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典途徑是二者結(jié)合后，促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和IκB激酶家族（IκB kinases，IKKε）磷酸化，最終分別活化轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1（AP-1）和核因子κB （NF-κB），促進(jìn)炎性反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β等的分泌，引發(fā)炎性反應(yīng)。有研究表明，LPS直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞生物力學(xué)特性發(fā)生變化，LPS增加可使內(nèi)皮細(xì)胞膜的黏度增加［8］。LPS可促進(jìn)人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）、軟骨細(xì)胞等增殖［9-10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HAEC在受到不同濃度LPS作用時，隨著LPS濃度的增加細(xì)胞活力逐漸降低，當(dāng)LPS濃度達(dá)10.0 μg/mL時，細(xì)胞活力反而上升，但繼續(xù)增加LPS濃度，細(xì)胞活力又逐漸降低；推測低濃度LPS對HAEC有損傷作用，而受到中濃度LPS作用時，LPS可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)［11］，經(jīng)Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作用促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度（1 000.0 μg/mL）LPS作用時對細(xì)胞可能產(chǎn)生毒性作用，從而使細(xì)胞活力降低。由于要觀察4′，5，7-三羥基異黃酮的作用，本研究選取了能導(dǎo)致細(xì)胞損傷的有效LPS濃度（0.1 μg/mL）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗，結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度4′，5，7-三羥基異黃酮干預(yù)后，細(xì)胞活力逐漸增加，說明適當(dāng)?shù)?′，5，7-三羥基異黃酮濃度可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

IL-6是一種分布廣泛的炎癥細(xì)胞因子，可通過體液和細(xì)胞免疫過程影響炎癥、介導(dǎo)宿主防御和組織損傷［12］。IL-6可作用于血管壁而引起其損傷，有研究表明，血管內(nèi)損傷可使TNF-α釋放增加，TNF-α又促進(jìn)IL-6的釋放增加［13］。本研究中，HAEC經(jīng)LPS刺激4 h后IL-6 的mRNA表達(dá)增加，說明此時細(xì)胞受到了損傷。而內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害又是AS過程中的始動環(huán)節(jié)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)［14］。ephrinB2是內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子，參與血管生成調(diào)控。ephrinB2與血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性關(guān)系密切，活化的ephrinB2主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞交匯處，是兩類細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)所必需的［15］。Steinle等［16］研究發(fā)現(xiàn)，用ephrinB2-Fc刺激正向信號會促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，HAEC經(jīng)LPS刺激后ephrinB2 mRNA表達(dá)增加，推測此時內(nèi)皮細(xì)胞的功能發(fā)生了改變。4′，5，7-三羥基異黃酮作為一種植物雌激素，在食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。Andrade等［17］研究發(fā)現(xiàn)，4′，5，7-三羥基異黃酮能降低LPS刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的黏附力，進(jìn)而表現(xiàn)出抗AS效應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示，低、中濃度4′，5，7-三羥基異黃酮能明顯抑制 ephrinB2及 IL-6 mRNA的表達(dá)，表明適當(dāng)濃度的4′，5，7-三羥基異黃酮可以減輕LPS誘導(dǎo)的HAEC損傷。但高濃度的4′，5，7-三羥基異黃酮卻反而表現(xiàn)出促進(jìn)ephrinB2及IL-6 mRNA的表達(dá)，推測可能與其高濃度對細(xì)胞的毒性作用有關(guān)。楊龍等［18］研究表明，高濃度的4′，5，7-三羥基異黃酮能誘導(dǎo)人肺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP超微結(jié)構(gòu)破壞，使細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至壞死。

綜上所述，LPS可以促使HAEC損傷，使ephrinB2 及IL-6的mRNA的表達(dá)水平上升，經(jīng)適當(dāng)濃度的4′，5，7-三羥基異黃酮干預(yù)后，ephrinB2及IL-6 mRNA的表達(dá)明顯減低，對LPS誘導(dǎo)的HAEC損傷起到一定的保護(hù)作用。

［1］朱磊，劉君，昌艷艷.動脈粥樣硬化與炎性因子的相關(guān)性研究［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2014，7（9）：250-251.

［2］Harja E，Bu DX，Hudson BI，et al.Vascular and inflammatory stresses mediate atherosclerosis via RAGE and its ligands in apoE-/-mice［J］.J Clin Invest，2008，118（1）：183-194.

［3］陳光強(qiáng)，朱琳，胡量，等.CRP對血管內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化及IL-6、MCP-1表達(dá)的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38（7）：46-49.

［4］張萍，鄭萬金，仲英.染料木素的研究進(jìn)展［J］.齊魯藥事，2008，27（2）：103-106.

［5］任嬌，孫惜時，田憬若，等.大豆異黃酮對內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展［J］.大豆科學(xué)，2014，33（1）：135-137.

［6］張雪梅，王高頻.阿托伐他汀對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2009，11（3）：214-217.

［7］李福榮，馮蕾，桑慧，等.芹菜籽提取物保護(hù)Toll樣受體4參與的內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2013，35（1）：56-59.

［8］王翔，王曉軍，羅向東，等.內(nèi)毒素直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞生物力學(xué)機(jī)理［J］.生物物理學(xué)報，1998，15（4）：804-811.

［9］程秋梅，潘延斌，譚美樂，等.來氟米特對脂多糖誘導(dǎo)下HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中國臨床新醫(yī)學(xué)，2014，7（4）：302-305.

［10］張城，宋勇，張藝，等.金雀異黃酮對脂多糖處理的軟骨細(xì)胞增殖抑制的拮抗及抗炎作用［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2011，2（24）：184-186.

［11］路玲，常文秀，曹書華，等.小劑量脂多糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2012，18（1）：47-51.

［12］周媛媛，沈捷，馬向華.白細(xì)胞介素-6與2型糖尿病及動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2009，36（8）：460-462.

［13］Guldiken B，Guldiken S，Turgut B，et al.The roles of oxidized low-density lipoprotein and interleukin-6 levels in acute atherothrombotic and lacunar ischemic stroke［J］.Angiology，2008，59（2）：224-229.

［14］陳鵬，戴敏.脂多糖對動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響［J］.中國動脈粥樣硬化雜志，2008，16（6）：495-498.

［15］Salvucci O，Maric D，Economopoulou M，et al.EphrinB reverse signaling contributes to endothelial and mural cell assembly into vascular structures［J］. Blood，2009，114（8）：1707-1716.

［16］Steinle JJ，Meininger CJ，F(xiàn)orough R，et al．Eph B4 receptor signaling mediates endothelial cell migration and proliferation via the phosphatidylinositol 3-kinase pathway［J］.J Biol Chem，2002，277（46）：43830-43835．

［17］Andrade CM，Sá MF，Toloi MR.Effects of phytoestrogens derived from soy bean on expression of adhesion molecules on HUVEC［J］.Climacteric，2012，15（2）：186-194.

［18］楊龍，陸紅玲，周正平，等.染料木素對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549/DDP超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，38（4）：397-400.

Effects of 4′，5，7 trihydroxyisoflavone on mRNA expression of ephrinB2 and IL-6 induced by LPS in human aortic en-dothelial cells*

Jiang Nian，Zhou Xuebing，Ou Gangwei，Lu Hongling△（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo study the effects of 4′，5，7 trihydroxyisoflavone on mRNA expression of ephrinB2 and IL-6 in duced by LPS in human aortic endothelial cells（HAEC）.MethodsHuman aortic endothelial cells were cultured in vitro and 0.1，1.0，10.0，100.0，1000.0 μg/mL of LPS was to stimulate HAEC for 4 h.The HAEC injury model was established.Then the cultured HAEC were divided into the model group（0.1 μg/mL LPS），low，middle and high 4′，5，7 trihydroxyisoflavone concentra tion groups（1.0，10.0，100.0 μm/mL respectively）；the cell vitality was detected by MTT assay.The mRNA expressions of ephrinB2 and IL-6 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsExcept for the 10.0，100.0 μg/mL LPS groups，the rest other concentration groups all could reduce the vitality of HAEC compared with the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），LPS could promote the mRNA expression of ephrinB2 and IL-6；the middle and high concentration 4′，5，7 trihydroxyisoflavone groups HAEC could promote the increase of HAEC vitality with statistical difference （P＜0.05）and the low and middle concentration 4′，5，7 trihydroxyisoflavone groups could significantly reduce the mRNA expression of ephrinB2 and IL-6 with statistical difference（P＜0.01）.ConclusionAppropriate concentration of 4′，5，7 trihdroxyisoflavone has a certain protective effect to LPS induced HAEC injury.

Isoflavones；Endothelial cells；Interleukin-6；Lipopolysaccharides；Cell proliferation；Inflammation；ephrinB2

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.002

A

1009-5519（2016）07-0966-03

貴州省科技廳聯(lián)合基金重點(diǎn)項目（黔科合J字LKZ［2013］14）。

姜念（1989-），在讀碩士研究生，主要從事心血管疾病分子生物學(xué)研究。

△，E-mail：l_hongling2@163.com。

（2015-12-10）