優(yōu)化胰蛋白酶消化強(qiáng)度進(jìn)行人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)探討*

謝　偉，秦雯，蔣凌云，莫馥華，朱時(shí)敏，顧克英，羅遠(yuǎn)富，覃愛(ài)平△（.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)生殖中心，廣西南寧500；.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧500；.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧500）

·論著·

優(yōu)化胰蛋白酶消化強(qiáng)度進(jìn)行人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)探討*

謝偉1，秦雯2，蔣凌云1，莫馥華1，朱時(shí)敏3，顧克英3，羅遠(yuǎn)富3，覃愛(ài)平1△（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)生殖中心，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021）

目的探討優(yōu)化改良的人子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。方法將2014年7月1日至2014年9月30日需行診斷性清宮術(shù)的患者21例分為0.125%胰蛋白酶組（A組）、0.250%胰蛋白酶組（B組）和1 mg/mL膠原酶組（C組）。同時(shí)結(jié)合使用100目濾網(wǎng)（150 μm）及400目（38 μm）濾網(wǎng)進(jìn)行子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞分離，比較各組間子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度和生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)成功19例，A組子宮內(nèi)膜組織污染1例，C組因細(xì)胞量過(guò)少接種失敗1例。細(xì)胞獲得后培養(yǎng)進(jìn)行上皮細(xì)胞團(tuán)百分比計(jì)算，A組為（85.71±1.38）%、B組為（75.28±1.50）%和C組為（84.86± 2.34）%，其中A組和C組的上皮細(xì)胞百分比高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)3～5 d后待細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)孔，免疫組化辣根過(guò)氧化物酶底物顯色（ABC法）進(jìn)行純度檢測(cè)，A組為（90.28±2.13）%、B組為（84.57±2.76）%和C組為（86.14±4.06）%，A組細(xì)胞純度均大于B、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞獲得數(shù)量和純度均高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論0.125%胰蛋白酶消化子宮內(nèi)膜組織結(jié)合100目濾網(wǎng)（150 μm）及400目（38 μm）濾網(wǎng)過(guò)濾，可以穩(wěn)定地獲得質(zhì)量良好的子宮內(nèi)膜上皮原代細(xì)胞。

子宮內(nèi)膜；上皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；胰蛋白酶

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.11.002

A

1009-5519（2016）11-1606-03

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是胚胎著床最先接觸的部位，也是婦女月經(jīng)周期變化的基礎(chǔ)。對(duì)子宮內(nèi)膜組織及細(xì)胞的研究是深入了解婦科疾病發(fā)病機(jī)制的重要手段，但由于臨床患者婦科疾病的特點(diǎn)及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的限制，子宮內(nèi)膜組織來(lái)源有限，單純臨床研究受到很大限制，所以子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)是研究子宮內(nèi)膜功能和基因調(diào)控的重要輔助手段。而人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)一直存在材料標(biāo)本容易污染，細(xì)胞分離困難、純度低、生長(zhǎng)緩慢及傳代效果不良等諸多問(wèn)題［1］。最常見(jiàn)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法主要有酶消化、篩網(wǎng)過(guò)濾/離心等。酶消化分離純化方法有膠原酶消化后分離純化上皮細(xì)胞［2］或多種消化酶聯(lián)合使用，如膠原酶、胰酶或分支酶按配方使用［3］，但試劑具有較昂貴、上皮細(xì)胞收獲小及間質(zhì)細(xì)胞多等缺點(diǎn)，篩網(wǎng)過(guò)濾有不同孔徑規(guī)格，需要配合優(yōu)化使用，而離心法相對(duì)要復(fù)雜一些。本文將從人子宮內(nèi)膜的取材、細(xì)胞分離、純化及培養(yǎng)等方面進(jìn)行一些改良，從而獲得較為滿意的原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和純化的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可為下一步的細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝及鑒定等實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源選擇2014年7月1日至2014年9月30日在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心就診需行診斷性清宮術(shù)的21例患者作為研究對(duì)象，所有患者診斷取材均進(jìn)行談話、詳細(xì)交代手術(shù)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程，并簽訂同意書。組織標(biāo)本部分送病理檢查，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確定，其中增生期15例，分泌期6例。剩余子宮內(nèi)膜標(biāo)本經(jīng)過(guò)整刮取材，去除大塊血塊及組織黏液，置專用細(xì)胞培養(yǎng)液中于4℃保存，30 min內(nèi)直接送實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步處理。

1.1.2試劑PRMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），四季青牌胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司），鼠抗人角蛋白抗體（Abcam公司），鏈霉素-生物素-過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠試劑盒（北京中杉公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司）。

1.2方法

1.2.1人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離和純化人子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，余下所有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞培養(yǎng)室完成，嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)操作流程完成。首先予以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復(fù)沖洗，再去除一些小的血塊和黏液。轉(zhuǎn)入清潔滅菌小瓶，將子宮內(nèi)膜組織剪碎成約1 mm3大小組織塊，按照實(shí)驗(yàn)分組給予一定濃度胰蛋白酶或膠原酶，在37℃下消化2～4 h，期間間隔1～5 min吹打組織1次，保證消化、分離細(xì)胞充分。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和參照文獻(xiàn)［4］按照消化子宮內(nèi)膜組織的胰蛋白濃度分組，具體如下：0.125%胰蛋白組（A組）7例（增生期5例，分泌期2例），消化時(shí)間 2～4 h；0.250%胰蛋白組（B組）7例（增生期6例，分泌期1例），消化時(shí)間2～4 h；1 mg/mL膠原酶組（C組）7例（增生期4例，分泌期3例），消化時(shí)間為1 h。以胎牛血清終止消化后，1000r/min離心，棄上清液，三組均再將沉淀分別予以100目濾網(wǎng)（150μm）及400目（38μm）濾網(wǎng)充分過(guò)濾。

1.2.2人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液反復(fù)沖洗400目（38 μm）過(guò)濾網(wǎng)，其中剩下的組織細(xì)胞團(tuán)大部分為上皮細(xì)胞團(tuán)，初步細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每毫升5×106個(gè)細(xì)胞密度將其接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，需進(jìn)行免疫組化等檢查的孔內(nèi)置放小玻璃片，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3培養(yǎng)液選擇使用改良的專用上皮細(xì)胞培養(yǎng)液（PRMI1640培養(yǎng)基），加入15%胎牛血清和0.5 mL青霉素-鏈霉素雙抗。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，定期換液。

1.2.4人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞傳代倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)孔細(xì)胞生長(zhǎng)到密度約90%時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)總結(jié)和純度檢測(cè)。

1.2.5子宮內(nèi)膜上皮免疫組化檢查當(dāng)細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后取出蓋玻片，以0.01 mol/L PBS洗滌2次，用多聚甲醛固定后，使用鼠抗人細(xì)胞角蛋白一抗作用，并設(shè)陰性對(duì)照（PBS）（4℃過(guò)夜），使用鏈霉素-生物素-過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，再用蘇木素復(fù)染。細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。三組每張片取10個(gè)不同的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)成功19例，A組子宮內(nèi)膜組織污染1例。C組因細(xì)胞量過(guò)少接種失敗1例。細(xì)胞獲得后種板前進(jìn)行上皮細(xì)胞團(tuán)百分比計(jì)算，A組為（85.71±1.38）%、B組（75.28±1.50）%和C組為（84.86± 2.34）%，其中A組和C組的上皮細(xì)胞百分比高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上皮細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁較慢，鋪滿6孔板需要3 d左右，而間質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)快，接種后0.5 h就可貼壁，生長(zhǎng)迅速，若上皮細(xì)胞純度不夠，間質(zhì)細(xì)胞可嚴(yán)重干擾子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞鑒定細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征上皮細(xì)胞呈現(xiàn)多角形或蝌蚪形，成團(tuán)或漩渦狀排列。細(xì)胞質(zhì)成細(xì)顆粒狀、核大、核仁明顯。免疫組織化學(xué)鑒定：腺體細(xì)胞團(tuán)角蛋白染色為棕色顆粒，即為陽(yáng)性細(xì)胞。見(jiàn)圖1～6。

2.3細(xì)胞純度檢驗(yàn)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞辣根過(guò)氧化物酶底物顯色（ABC法）進(jìn)行免疫組化檢查，腺體細(xì)胞團(tuán)角蛋白染色為棕色顆粒，計(jì)算10個(gè)視野中上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的比例。各組上皮細(xì)胞純度檢測(cè)：A組為（90.28± 2.13）%、B組（84.57±2.76）%和C組（86.14±4.06）%，A組細(xì)胞純度均高于B、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2、3。

圖1　子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞A組（100×）

圖2　子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞B組（100×）

圖3　子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞C組（100×）

圖4　子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞A組（400×）

圖5　子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞B組（400×）

圖6　子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞C組（400×）

3　討　論

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是研究子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)方法之一，獲得較高純度的原代上皮細(xì)胞有許多方法，但對(duì)于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系尚有很多亟待解決的問(wèn)題。其中消化酶的選擇就有多種，早在20世紀(jì)90年代就有胰蛋白酶使用的相關(guān)報(bào)道［5］。胰蛋白酶消化能力較強(qiáng)，因而較多地在細(xì)胞傳代中使用。胰蛋白酶是專一作用于有堿性氨基酸——精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵，具有較強(qiáng)的消化分離細(xì)胞的能力，是一種有利于分解上皮細(xì)胞間較多的緊密連接方式［6］。分析胰蛋白酶在人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)中可行原因如下：（1）子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞成團(tuán)狀，抗胰酶消化能力強(qiáng)，團(tuán)塊中間的上皮細(xì)胞不易受到胰酶的消化、損害。（2）子宮內(nèi)膜組織基質(zhì)細(xì)胞豐富，且容易分散，而上皮細(xì)胞較少，成團(tuán)塊，較難分散，2種細(xì)胞特性差異較大?；|(zhì)細(xì)胞承擔(dān)了大部分的胰酶消化能力，有利于保護(hù)上皮細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)胰酶的強(qiáng)消化能力可以減少基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，有利于細(xì)胞的純化。（3）子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞存在較多的緊密連接，不容易被分離，需要使用消化能力較強(qiáng)的酶。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的特點(diǎn)對(duì)胰蛋白酶的作用進(jìn)行重點(diǎn)改進(jìn)，主要是濃度調(diào)整、結(jié)合不同孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾，以獲得最佳質(zhì)量的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。其中A組0.125%胰蛋白酶消化子宮內(nèi)膜組織，同時(shí)輔助100目濾網(wǎng)（150 μm）及400目（38 μm）濾網(wǎng)過(guò)濾來(lái)獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，且不易出現(xiàn)過(guò)度消化的現(xiàn)象，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相似［7-8］。

在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)中分離細(xì)胞的數(shù)量是關(guān)鍵，細(xì)胞數(shù)太少容易引起種細(xì)胞失敗，細(xì)胞數(shù)太多可出現(xiàn)分離的細(xì)胞純度下降，所以要根據(jù)不同子宮內(nèi)膜組織量和消化個(gè)體差異，選擇不同的酶消化時(shí)間，既要充分消化，又要避免過(guò)度消化［9］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)情況選擇2～4h，且需及時(shí)調(diào)整。

團(tuán)塊狀分布的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分離根據(jù)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特性，上皮細(xì)胞容易成團(tuán)分布，而間質(zhì)細(xì)胞分散分布，上皮細(xì)胞貼壁慢，而間質(zhì)細(xì)胞貼壁快，所以在用胰蛋白酶消化后需要使用一定孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾。但分離的孔徑和次數(shù)需要經(jīng)過(guò)探索，Sinha等［10］認(rèn)為使用75 μm濾網(wǎng)一次過(guò)濾即可以獲得較多的間質(zhì)細(xì)胞，但上皮細(xì)胞較少。有文獻(xiàn)報(bào)道了38 μm濾網(wǎng)在子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)方面的作用［11-13］，本實(shí)驗(yàn)使用150 μm和38μm 2種孔徑濾網(wǎng)進(jìn)行子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)，取得較好的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞數(shù)量和純度。150 μm用來(lái)除去血塊黏液雜質(zhì)和沒(méi)有起作用的消化大細(xì)胞組織團(tuán)塊，38 μm用來(lái)分離子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，從而達(dá)到較為滿意的效果。

在獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的質(zhì)量比較中，本研究發(fā)現(xiàn)，A組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的質(zhì)量最好、純度高，細(xì)胞培養(yǎng)密度均勻，見(jiàn)圖1、4。提示0.125%胰蛋白酶的良好消化作用，在細(xì)胞消化中掌握好消化時(shí)間，結(jié)合濾網(wǎng)過(guò)濾可以取得良好的細(xì)胞培養(yǎng)效果。

在細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇方面，由于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)比較緩慢，需要使用改良專用細(xì)胞培養(yǎng)液，除了在培養(yǎng)基選擇方面使用有利于上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的PRMI1640培養(yǎng)基外，還需要對(duì)胎牛血清濃度進(jìn)行調(diào)整。本研究中加大了胎牛血清的濃度，在普通細(xì)胞培養(yǎng)的10%的基礎(chǔ)上加大了5%，給予細(xì)胞更充分的營(yíng)養(yǎng)支持，使用發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)較好，而并不會(huì)對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)造成影響［14］。

在防止細(xì)胞及取材污染方面，組織或細(xì)胞受到污染就意味著整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗，所以需要嚴(yán)格進(jìn)行操作。在組織取材中，首先要進(jìn)行仔細(xì)的外陰皮膚及陰道消毒準(zhǔn)備，動(dòng)作輕柔，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行，取得組織材料后要及時(shí)送檢，4℃保存，取材組織器材和裝組織的材料要進(jìn)過(guò)高壓滅菌消毒［15］。本研究中僅1例標(biāo)本污染，事后分析是當(dāng)時(shí)時(shí)間較緊、裝組織材料的小瓶消毒不嚴(yán)格、送檢時(shí)間偏長(zhǎng)所致，因此后續(xù)研究時(shí)需注意。

綜上所述，取材前嚴(yán)格無(wú)菌準(zhǔn)備器械和材料，使用0.125%胰蛋白酶消化加150 μm和38 μm孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾可以獲得較多的上皮細(xì)胞，同時(shí)適當(dāng)提高培養(yǎng)液的胎牛血清濃度有利于建立穩(wěn)定的原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系。

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Study on culture technology of human endometrial epithelial cells by optimizing trypsin digestion intensity*

Xie Wei1，

Qin Wen2，Jiang Lingyun1，Mo Fuhua1，Zhu Shimin3，Gu Keying3，Luo Yuanfu3，Qin Aiping1△（1.Reproduction Center，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China；2.Department of Pathology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital ofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China；3.GuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China）

ObjectiveTo investigate an optimized and improved culture technology of primary human endometrial epithelial cells.MethodsTwenty-one patients undergoing diagnostic uterine curettage from July 1 to September 30，2014 were divided into the 0.125%trypsin group（A），0.250%trypsin group（B）and 1mg/mL collagenase group（C）.Meanwhile 100-mesh strainer（150 μm）and 400-mesh strainer（38 μm）were used to separate the endometrial epithelial cells and interstitial cells.Then the cells purity and growth state were compared among various groups.ResultsNineteen cases succeeded in the endometrial epithelial cell culture.One case in the group A was contaminated by endometrial tissues，1 case in the group C failed in the inoculation due to too little cell amount.In conducting the epithelial cell cluster percentage calculation after obtaining cells and inoculating，the group A was（85.71±1.38）%，group B was（75.28±1.50）%and group C was（84.86±2.34）%，in which the percentage of epithelial cells in the group A and C was higher than that in the group B，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.After the cells basically overspread the culture holes by 3-5 d of cell culture，the purity was detected by using the immunohistochemistry ABC method，the group A was（90.28±2.13）%，group B was（84.57±2.76）%and group C was（86.14±4.06）%.The purity of the group A was higher than that of the group B and C，and the difference had statistic significance（P＜0.05）.The acquired endometrial epithelial cells amount and purity in the group A were higher than those in the other two groups，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion0.125%trypsin digesting endometrial tissues and combining with the filtration by 100-mesh strainer（150 μm）and 400-mesh strainer（38 μm）can stably acquire good-quality primary endometrial epithelial cells.

Endometrium；Epithealial cells；Cell cutture techniques；Trypsin

廣西優(yōu)秀博士論文培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（YCBZ2014033）。

謝偉（1977-），副主任醫(yī)師，主要從事生殖醫(yī)學(xué)方面的工作。
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，E-mail：fenglingcao1980@163.com。

（2016-02-27）