LIGHT作為EBNA1 DNA疫苗佐劑的免疫效應研究

盧曉華，鄒軍輝，鄭　威，楊建設，王　蒲△（.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070；.中國科學院深圳先進技術研究院生物醫藥與技術研究所，廣東深圳58055）

LIGHT作為EBNA1 DNA疫苗佐劑的免疫效應研究

盧曉華1，2，鄒軍輝2，鄭威2，楊建設1，王蒲2△（1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070；2.中國科學院深圳先進技術研究院生物醫藥與技術研究所，廣東深圳518055）

目的研究LIGHT作為免疫佐劑在EB病毒核抗原1（EBNA1）DNA疫苗誘導免疫反應中的作用。方法以Balb/c小鼠肝臟cDNA為模板，PCR擴增構建真核表達載體pcDNA3.1-LIGHT；轉染細胞，驗證LIGHT蛋白的表達；采用電脈沖方法，以LIGHT質粒為佐劑與EBV DNA疫苗聯合免疫小鼠，測定血清中EBNA1特異性抗體；分離和收集小鼠脾臟淋巴細胞，經EBNA1抗原刺激后，測定細胞因子干擾素-γ（IFN-γ）的分泌水平。結果PCR擴增出LIGHT目的片段，大小為720 bp；蛋白質免疫印跡法（Western blotting）鑒定結果：在蛋白Marker相對分子質量26×103上方有單一清晰目的條帶，表明有LIGHT蛋白表達；免疫小鼠血清測定實驗結果：LIGHT聯合DNA疫苗實驗組的抗體滴度是單獨DNA疫苗免疫組的3倍；脾淋巴細胞因子測定結果表明LIGHT聯合免疫組能明顯增強IFN-γ的分泌。結論LIGHT作為免疫佐劑，可依賴其介導的信號通路對抗體的產生和相關細胞因子的分泌具有顯著促進作用。

皰疹病毒4型，人；疫苗，DNA；佐劑，免疫；LIGHT；電脈沖免疫

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種人類γ皰疹病毒，在人群中感染非常普遍［1］，與多種疾病的發生有關，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌等［2］。EB病毒核抗原1（EBNA1）是EBV感染人體后編碼表達的DNA結合蛋白，是EBV DNA復制、病毒基因維持終生感染和B淋巴細胞永生化過程中唯一必需的病毒蛋白［3-4］。DNA疫苗將編碼EBNA1的基因構建到真核表達載體，再直接導入機體，激發機體產生特異性體液和細胞免疫應答。為了提高DNA疫苗的免疫原性和免疫效果，一方面在疫苗中加入佐劑聯合免疫，增強機體免疫應答水平［5-6］；另一方面采用電脈沖（electric pulse，EP）介導的免疫方法［7-9］，提升DNA疫苗的表達水平，從而提高疫苗的免疫原性［7］。LIGHT屬于腫瘤壞死因子超家族成員（TNFSF14）［10-11］，是一種非CD28依賴的共刺激分子；LIGHT與其功能受體結合介導的LIGHT-HVEM/LTβR信號通路，通過刺激T細胞活化和增殖［12］及誘導靶細胞凋亡［13］，在抗病毒感染免疫中發揮重要作用［14-15］。本研究以LIGHT質粒DNA作為EBNA1 DNA疫苗的佐劑，通過LIGHT的表達增強EBNA1特異性抗體的產生和T淋巴細胞活化，有效增強DNA疫苗的免疫效應。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選擇雌性Balb/c小鼠24只，年齡6～8周，無特定病原體級（SPF級），購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.1.2菌株與試劑大腸埃希菌DH5α及質粒pcD-NA3.1（+）和質粒pcDNA3.1-EBNA1為本實驗室保存，限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶購自Takara公司，DNA Marker、蛋白Maker、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1LIGHT全長序列的PCR擴增根據LIGHT全長序列（239個氨基酸），利用軟件Primer Premier 5.0進行引物設計。上游引物LIGHT-F：5′CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGAGTGTGGTACAGCC 3′、下游引物LIGHTR：5′GGAATTCGACCATGAAAGCTCCGAAAT 3′；其中上游引物和下游引物分別添加HindⅢ和EcoRⅠ限制性酶切位點，引物均由Invitrogen公司合成。從Balb/c小鼠肝臟組織中提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA；再以cDNA為模板，利用LIGHT特異性引物，進行PCR擴增，以小鼠肝臟cDNA為模板，擴增LIGHT膜外區全長。PCR反應體系（100 μL）：5×Buffer 20 μL、dNTP mix 8 μL、DNA 6 μL、LA Taq酶1 μL、引物混合物4 μL、雙蒸水61μL；反應參數為：95℃2min，95℃15s，68℃15s，72℃3 min，共35個循環，最后再72℃延伸8 min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收PCR產物。

1.2.2LIGHT重組質粒的構建和鑒定將1.2.1項回收的PCR產物和pcDNA3.1（+）質粒，利用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ分別進行酶切反應，再分別進行酶切產物瓊脂糖凝膠電泳回收，然后分別將回收的酶切產物LIGHT以摩爾比6∶1的比例與pcDNA3.1（+）酶切產物混合，加入T4 DNA連接酶，22℃連接1 h，進行連接反應。將連接產物轉化感受態DH5α，然后用含氨芐青霉素抗性的平板篩選陽性克隆，挑取陽性單克隆經菌落PCR和質粒雙酶切鑒定后，送Invitrogen公司測序鑒定，最后大量抽提無內毒素的重組質粒。

1.2.3LIGHT蛋白的表達和鑒定將無內毒素pcDNA-LIGHT質粒利用jetPRIME轉染試劑轉染到生長密度已達80%的人源胚胎腎細胞（HEK）293 T細胞，在5%CO2、37℃條件下用10%胎牛血清（FBS）DEME培養基培養48 h后，分離和收集培養細胞，采用蛋白質免疫印跡法（Western blotting）分析并鑒定293 T細胞中LIGHT蛋白表達水平。

1.2.4電脈沖免疫方法和動物免疫SPF級Balb/c小鼠，隨機分為四組（6只/組），先分別肌內注射EBNA1質粒DNA疫苗和LIGHT質粒佐劑混合液，每只每次劑量為50 μg；再利用NEPA GENE動物電轉儀，在電壓80 V、脈沖次數6次、脈沖間隔25 ms、頻率2 Hz條件下電轉刺激；于第0、2、4、6周觀察免疫反應，第7周處死Balb/c小鼠，檢測特異性細胞免疫和體液免疫應答。

1.2.5免疫小鼠血清分離和抗體滴度的檢測

1.2.5.1血清制備分別在3、5、7周于Balb/c小鼠眼眶取血約100 μL，血樣室溫靜置1 h，離心分離血清，血清樣品保存于-20℃待測。

1.2.5.2血清中EBNA1抗體滴度的檢測首先將原核表達純化的EBNA1蛋白包被于微孔板，經封閉和洗滌后；將分離的血清倍比稀釋分別加入到酶標板孔內，同時做陽性和陰性對照孔，37℃孵育；再經洗滌步驟后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，依次經過孵育和洗滌步驟后；加入3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）底物顯色液，孵育3 min后，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應，于450 nm測定吸光度值。將免疫小鼠第3、5周的血清收集和分離后，利用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定血清中EBNA1特異性抗體滴度。

1.2.6小鼠脾細胞懸液制備和細胞因子的檢測

1.2.6.1小鼠淋巴細胞的制備（1）處死免疫的小鼠后，于75%乙醇中浸泡消毒，在無菌超凈工作臺進行操作；無菌條件下取出小鼠脾臟，置于DMEN無血清培養基中，研磨分散脾細胞，離心，棄上清液；（2）加入4℃預冷的紅細胞裂解液（Tris1.3g，NH4Cl3.55g，定容至500mL，調節pH至7.2，高壓滅菌，4℃保存備用），裂解后，離心，棄上清液；（3）加入無血清培養基洗滌細胞2次后，離心，棄上清液，再用含10%FBS的完全培養基重懸細胞，混勻；（4）在細胞計數儀中進行細胞計數，按照所得細胞數調整細胞濃度至每毫升1×107個；（5）最后每孔加入50μL制備的淋巴細胞，總體積200 μL（每孔細胞總數為5× 105個）；實驗組加入終濃度為1μg/mL的EBNA1蛋白（陽性對照不加蛋白），加入終濃度為1 μg/mL的ConA，陰性對照不加蛋白，然后加完全培養液。置于37℃CO2培養箱中培養36 h。

1.2.6.2細胞因子IFN-γ的檢測將分離的細胞培養上清，嚴格按照IFN-γ檢測試劑盒說明書，測定細胞表達分泌IFN-γ水平。

2　結　果

2.1LIGHT編碼區全長基因的克隆及重組質粒載體的構建經瓊脂糖凝膠電泳，可見720 bp大小的LIGHT片段（圖1）。將PCR擴增產物回收后，經HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后與真核表達載體pcDNA3.1（+）連接，構建重組質粒pcDNA3.1-LIGHT。LIGHT質粒轉化大腸埃希菌感受態DH5α和篩選后，菌落PCR和雙酶切鑒定結果（圖2）顯示，雙酶切后的質粒在720 bp處有明顯目的條帶；質粒DNA測序結果進一步證明pcDNA3.1-LIGHT載體構建成功。

圖1　PCR擴增LIGHT目的片段

圖2　LIGHT重組質粒的雙酶切鑒定結果

2.2LIGHT真核載體在HEK 293T細胞中的表達

LIGHT編碼區全長基因編碼239個氨基酸，蛋白相對分子質量為26 340（單體且未糖基化時）。LIGHT質粒轉染293T細胞后，分別收集細胞和培養上清液，蛋白質免疫印跡法結果顯示，在蛋白Marker 26×103上方附近處顯示單一清晰條帶，與LIGHT的預期相對分子質量26 340相符；LIGHT真核表達載體在293T細胞中正確表達，且所表達的目的蛋白具有很好的免疫原性。見圖3。

圖3　LIGHT真核載體的表達鑒定

2.3LIGHT佐劑對EBNA1 DNA疫苗特異性抗體滴度的影響ELISA測定結果顯示，單獨的EBNA1 DNA疫苗能夠產生特異性抗體，滴度達4.5×104，而加入LIGHT佐劑的DNA疫苗較單獨的疫苗，其EBNA1特異性抗體滴度高2.6倍，抗體滴度達1.16×105，說明LIGHT佐劑能夠增強DNA疫苗體液免疫應答。見圖4。

2.4LIGHT佐劑對DNA疫苗細胞免疫應答的影響

免疫周期的第5周，將Balb/c小鼠處死，在無菌條件下分離脾淋巴細胞，以EBNA1蛋白作為特異性抗原刺激、ConA為陽性對照，測定DNA疫苗細胞免疫應答效應，同時也分析LIGHT佐劑的免疫增強效應。淋巴細胞經EBNA1蛋白刺激后，重組DNA疫苗免疫小鼠的淋巴細胞較陰性對照組具有更強分泌IFN-γ的能力，混合LIGHT佐劑的EBNA1DNA疫苗免疫組（LIGHT+EBNA1），其細胞因子IFN-γ分泌水平較EBNA1蛋白刺激免疫組提高1倍，也證實了LIGHT佐劑混合重組EBV DNA疫苗能提高疫苗的細胞免疫應答反應能力。見圖5。

圖4　不同免疫小鼠血清EBNA1特異性抗體滴度測定情況

圖5　各組免疫小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ水平測定情況

3　討　論

EBV作為一種致瘤病毒，由于其感染的廣泛性和普遍性，迫切需求EB病毒疫苗的研發，目前已初步研究出多種疫苗［12，16-17］；選擇更好的靶點、免疫方式和免疫佐劑，以最大限度地阻斷EB病毒感染和殺傷感染細胞是EBV疫苗研究的發展方向。

DNA疫苗由于其易于改造、可塑性強、生產便捷、穩定性好、安全性高、運輸方便，以及不僅能誘導機體體液免疫應答，還能增強細胞免疫應答等諸多優點而備受關注；在病毒性疾病和自身免疫性疾病等領域已經取得重大進展，并已有疫苗獲批上市。免疫原性和有效性是DNA疫苗研發的重點和難度，在疫苗發揮免疫效應過程中，抗原提呈細胞（特別是樹突狀細胞）扮演著重要角色；因此，從促進樹突狀細胞功能角度出發，是提高DNA疫苗免疫效應的可行策略。

LIGHT與其功能性受體LTβR和HVEM結合［11，13，18］所介導的信號通路是樹突狀細胞數量的維持和遷移的重要基礎，能夠誘導樹突狀細胞的成熟［19-20］，促進其抗原提呈能力，從而增強機體的細胞免疫應答［5，14］（包括刺激T細胞的增殖和分化、細胞因子IFN-γ的分泌）；此外，LIGHT還可促進B淋巴細胞的分化及特異性IgG 和IgM的產生，增強機體的體液免疫應答［14］。

電脈沖免疫方法［21］是利用電脈沖的作用首先在細胞質膜上形成親水性的孔，增加質膜的通透性，以便于質粒DNA借助電泳作用進入細胞。有研究表明，電脈沖免疫法能夠顯著提高DNA進入細胞的數量，從而提高質粒的細胞轉染率；進而增加目的蛋白的表達，有研究表明，電脈沖免疫方法比純DNA注射，其目的蛋白表達增加100～1 000倍［7］，有效增強DNA疫苗的免疫原性，表現為高抗體滴度和特異性T細胞應答增加。

本研究結果也證實了混合LIGHT的EBNA1 DNA疫苗所誘導的體液免疫應答和細胞免疫應答均顯著高于單獨的EBNA1DNA疫苗。因此，LIGHT有望成為EBNA1 DNA疫苗的免疫佐劑，為開發EBV相關腫瘤和疾病的治療性疫苗奠定基礎。

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Study on immune effect of LIGHT as adjuvant of EBNA1 DNA vaccine

Lu Xiaohua1，2，Zou Junhui2，Zheng Wei2，Yang Jian-

she1，WangPu2△（1.CollegeofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou，Gansu730070，China；2.InstituteofBiomedicine and Biotechnology，Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen，Guangdong 518055，China）

ObjectiveTo study the effect of LIGHT as an adjuvant in the immune responses induced by EB viral nuclear antigen1（EBNA1）DNA vaccine.MethodsThe liver cDNA of Balbc/c mouse served as the template.The eukaryotic expression vector pcDDNA3.1-LIGHT was constructed by PCR amplification；the cell transfection was conducted，the LIGHT protein expression was verified；by adopting the electric pulse method，the mouse was immunized with the LIGHT plasmid as the adjuvant combined with EBV DNA vaccine.The specific antibody of serum EBNA1 was detected.The mouse spleen lymphocytes were separated and collected.After stimulation by EBNA1 antigen，cytokine IFN-γ secretion level was detected.ResultsThe LIGHT target fragment was amplified by PCR，which was about 720 bp，the Western blot identification results showed that a single clear target band was above 26×103，demonstrating that LIGHT protein was expressed；the serum detection results in the immune mouse showed that the antibody titer in the LIGHT combined DNA vaccine experimental group was 3 times of that in the single DNA vaccine immune group；the spleen lymphocyte factor detection results showed that the LIGHT combined immune group could significantly increase the IFN-γ secretion.ConclusionLIGHT as the adjuvant has significant promoting effect in the generation of antibody and secretion of related cytokines by depending on its mediated signal pathway.

Herpesvirus 4，human；Vaccines，DNA；Adjuvants，immunologic；LIGHT；Electroporation

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.11.006

A

1009-5519（2016）11-1618-04

盧曉華（1990-），碩士研究生，主要從事病毒疫苗的研究。
△

，E-mail：pu.wang@siat.ac.cn。

（2016-02-21）