痹痛消膠囊對大鼠類風濕性關節炎的作用及其機制

陳玉興， 卓俊城， 黃雪君， 曾曉會， 姚 楠， 黃丹娥， 甘海寧（.廣東省中醫藥工程技術研究院廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州50095；.廣州中醫藥大學，廣東廣州50405）

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痹痛消膠囊對大鼠類風濕性關節炎的作用及其機制

陳玉興1， 卓俊城2， 黃雪君1， 曾曉會1， 姚 楠1， 黃丹娥1， 甘海寧1
（1.廣東省中醫藥工程技術研究院廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州510095；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州510405）

目的 探討痹痛消膠囊 （青風藤、土茯苓、骨碎補等）對大鼠類風濕性關節炎的治療作用及其作用的相關機制。方法 70只SD大鼠除10只作為正常對照組，其余皮下注射Freund's完全佐劑建立類風濕性關節炎大鼠模型，造模成功后分組給藥2周，觀察給藥后痹痛消膠囊高、中、低劑量對類風濕性關節炎大鼠足關節腫脹度、血清超敏C反應蛋白 （hsCRP）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含有量的影響，以及組織病理學觀察。結果痹痛消膠囊明顯抑制類風濕性關節炎大鼠足關節腫脹度，顯著降低類風濕性關節炎大鼠血清中hsCRP、IL-1β和TNF-α的含有量，明顯減輕足關節軟骨病變程度。結論 痹痛消膠囊具有較好的治療類風濕性關節炎作用，其作用機制可能與下調其hsCRP、IL-1β、TNF-α的含有量有關。

痹痛消膠囊；大鼠；類風濕性關節炎；血清超敏C反應蛋白 （hsCRP）；白介素-1β（IL-1β）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）；足關節腫脹

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）以慢性、多發性、關節腫痛為主要表現，屬自身免疫疾病［1］，我國的 RA患病率大約在0.3%左右［2-3］。RA患者易出現骨質破壞，造成不同程度的關節功能障礙和畸形，最終導致勞動力喪失。RA表現多發、難治、預后差、危害大的特點，針對RA發病機制尋找有效的治療措施具有重要意義［4］。現階段西醫對于RA的治療主要應用非甾體類抗炎藥、糖皮質激素和一些生物制劑等，臨床取得了一定療效，但亦存在不良反應較多、難以長期應用的不足。許多RA患者轉向中醫治療，臨床亦取得較好療效。RA在中醫學屬 “痹癥”范疇，中醫中藥治療RA獨具自身優勢［5］。中醫學認為RA本虛標實，內因為陰陽受損、營衛不和、氣血虧虛，外因為六淫邪氣［6］。痹痛消膠囊根據RA的內因外因經臨床多年應用總結形成，組方藥味有青風藤、土茯苓、骨碎補、補骨脂、杜仲、當歸、三七、澤蘭、甘草，具有祛風除濕、活血通絡、消腫止痛的功效，對中醫臨床 “風濕痹痛”有較好的治療作用，本實驗進行了痹痛消膠囊抗大鼠類風濕性關節炎的實驗研究，為痹痛消膠囊臨床應用提供實驗性參考依據。

1　材料與儀器

1.1動物 SD大鼠，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號44007200007843。

1.2藥物 痹痛消膠囊由廣東省中醫研究所制劑室制備提供，批號140312；塞來昔布膠囊 （國藥準字J20130063，Pfizer Pharmaceutica1s LLC，口服，0.2 g/粒，批號BK13CCEK079）；痹祺膠囊（國藥準字Z10910026，天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，0.3 g/粒，批號301908）。

1.3試劑 Freund's Adjuvant Comp1ete（美國Sigma-A1drich公司，批號Lot#SLBH7316V）；ELISA Kit for Rat hsCRP、ELISA Kit for Rat IL-1β（上海西唐生物科技有限公司，批號1311251、1309261）；ELISA Kit for Rat TNF-α（上海博谷生物科技有限公司，批號20130103）；甲醛 （廣州化學試劑廠，批號20130409-1）；無水乙醇 （天津威晨化學試劑科貿有限公司，批號20130318）。

1.4儀器 JJ3000動物電子秤 （常熟市雙杰測試儀器廠）；BS224S電子天平 （德國Sartorius）；HH-6數顯恒溫水浴鍋 （金壇市富華儀器有限公司）；3K30離心機（德國Sigma公司）；YLS-7A足趾容積測量儀 （山東醫學科學院設備站）；Bio-RAD 680酶標儀（美國Bio-Rad公司）；病理組織學切片全套設備；O1ympus DP2-BSW病理圖像采集系統（日本O1ympus公司）。

2　方法

2.1模型制備 取SD大鼠70只，隨機留取10只作為正常對照組，其余60只大鼠作為類風濕性關節炎模型組。造模型前，各大鼠用YLS-7A足趾容積測量儀測定造模前大鼠右后足跖正常體積。測量

后，模型組60只大鼠均右后足趾處皮下注射Freund's完全佐劑0.15 mL誘導RA大鼠模型，正常對照組10只大鼠同法皮下注射生理鹽水0.15 mL。造模后第10天，各大鼠同上法進行右后足跖體積測量，計算造模10 d給藥前足跖腫脹度 （造模10 d給藥前足跖腫脹度=造模10 d右后跖體積-造模前右后足跖正常體積）。

2.2分組給藥 造模成功后，60只模型大鼠按足跖腫脹度分為6組，分別為模型對照組，塞來昔布膠囊組（36 mg/kg），痹祺膠囊組（0.324 g/kg），痹痛消膠囊高 （0.972 g/kg）、中 （0.486 g/kg）、低 （0.243 g/kg）劑量組。各給藥組按劑量灌胃給藥，正常對照組、模型對照組給予等體積蒸餾水，每日1次，連續14 d。

2.3檢測指標 末次給藥后1 h，各組大鼠同上法進行右后足跖體積測量，計算給藥后足跖腫脹度（給藥后足跖腫脹度=給藥后右后足跖體積-造模前右后足跖正常體積）。測量后取血，放置，離心，取上清液，按試劑盒說明書介紹的方法檢測hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量。關節組織病理學檢測：取右后足跖處關節部位，大體觀察后常規固定、脫鈣、包埋、封片、染色，光鏡觀察關節病變，包括滑膜組織增生、軟骨下骨質破壞和血管翳的形成。病理損傷評分分為5級［7-8］：0分為正常；1分為輕微局部炎性細胞浸潤；2分為中度炎性細胞浸潤；3分為重度炎性細胞浸潤，無軟骨損傷、血管翳形成；4分為重度炎性細胞浸潤并伴有血管翳形成和 （或）軟骨、骨質破壞。

2.4統計學處理 SPSS 15.0軟件統計，數據采用均數加減標準差 （±s）表示，單因素方差分析（one-way ANOVA）結果。

3　結果

3.1痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠足跖腫脹度的影響 造模10 d給藥前，與正常對照組比較，模型對照組，塞來昔布膠囊組，痹祺膠囊組，痹痛消膠囊高、中、低劑量組大鼠造模后足跖腫脹度均顯著增大 （P＜0.01），模型對照組，塞來昔布膠囊組，痹祺膠囊組，痹痛消膠囊高、中、低劑量組之間兩兩比較，大鼠造模后足跖腫脹度均無明顯差異 （P＞0.05）。給藥14 d后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠足跖腫脹度顯著增大 （P＜0.01）；與模型對照組比較，痹痛消膠囊高、中、低劑量組大鼠足跖腫脹度明顯減小 （P＜0.01）。見表1。

表1　痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠足跖腫脹度的影響 （n=10，±s）Tab.1 Effects of Bitongxiao Capsu les on paw swelling of ratswith rheumatoid arthritis（n=10，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，##P＜0.01

組別　　　劑量/（g·kg-1）　　　造模10 d給藥前足跖腫脹度/mL　　　給藥后足跖腫脹度/m L正常對照組　　　—0.003±0.013　　0.004±0.017模型對照組　　　—　　0.563±0.064**　　0.687±0.107**塞來昔布膠囊組　　0.036　　0.543±0.071**　　0.456±0.072##痹祺膠囊組　　0.324　　0.563±0.104**　　0.497±0.106##痹痛消膠囊高劑量組　　0.972　　0.544±0.075**　　0.405±0.072##痹痛消膠囊中劑量組　　0.486　　0.564±0.095**　　0.397±0.072##痹痛消膠囊低劑量組　　0.243　　0.585±0.102**　　0.476±0.092##

3.2痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量均顯著增加 （P＜0.01）。與模型對照組比較，痹痛消膠囊高、中、低劑量組大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量均明顯減小（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2　痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量的影響（n=10，±s）Tab.2 Effects of Bitongxiao Capsules on hsCRP，IL-1β，TNF-αcontents of rats w ith rheumatoid arthritis（n=10，±s）

表2　痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠血清hsCRP、IL-1β、TNF-α含有量的影響（n=10，±s）Tab.2 Effects of Bitongxiao Capsules on hsCRP，IL-1β，TNF-αcontents of rats w ith rheumatoid arthritis（n=10，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別　　　劑量/（g·kg-1）　　hsCRP/（ng·mL-1）　　IL-1β/（pg·m L-1）　　TNF-α/（pg·m L-1）正常對照組　　　—46.562±7.692　　268.906±129.140　　102.792±11.948模型對照組　　　—　　93.749±4.573**　　608.438±79.416**　　228.792±31.106**塞來昔布膠囊組　　0.036　　67.282±4.867##　　413.125±103.238##　　141.750±24.200##痹祺膠囊組　　0.324　　74.196±1.819##　　478.438±93.808#　　155.542±13.770##痹痛消膠囊高劑量組　　0.972　　64.540±4.872##　　393.906±125.133##　　138.375±18.571##痹痛消膠囊中劑量組　　0.486　　68.458±5.340##　　432.031±149.224##　　142.167±22.322##痹痛消膠囊低劑量組　　0.243　　71.277±3.394##　　474.531±93.921#　　153.542±9.564##

3.3痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠關節組織病理學的影響 關節組織病理學評分：與正常對照組比較，模型對照組大鼠關節組織病理學評分顯著增大 （P＜0.01）。與模型對照組比較，痹痛消膠囊高、中、低劑量組大鼠關節組織病理學評分均明顯減小 （P＜0.01）。見表3。

表3　痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠關節組織病理學評分的影響（n=10，±s）Tab.3 Effects of Bitongxiao Capsules on histopathological score of rats joint w ith rheumatoid arthritis（n= 10，±s）

表3　痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠關節組織病理學評分的影響（n=10，±s）Tab.3 Effects of Bitongxiao Capsules on histopathological score of rats joint w ith rheumatoid arthritis（n= 10，±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，##P＜0.01

組別　　　劑量/（g·kg-1）關節組織病理學評分/分正常對照組　　　—0.000±0.000模型對照組　　　—　　3.200±0.632**塞來昔布膠囊組　　0.036　　1.400±0.516##痹祺膠囊組　　0.324　　2.300±0.675##痹痛消膠囊高劑量組　　0.972　　1.700±0.483##痹痛消膠囊中劑量組　　0.486　　1.700±0.675##痹痛消膠囊低劑量組　　0.243　　2.200±0.632##

關節組織病理學照片：正常對照組大鼠關節處未出現病理改變，軟骨結構完整，軟骨表面光滑。模型對照組大鼠關節出現病理改變，表現為軟骨表面局部粗糙不平，缺失形成潰瘍，軟骨基質水腫，見輕度增生和炎細胞浸潤。痹痛消膠囊組和塞來昔布膠組、痹祺膠囊組在病變范圍和病變嚴重程度方面與模型組比較均有降低或減輕，組織水腫、變性、簇聚和壞死方面均輕于模型組。見圖1。

4　討論

中醫學認為RA病因是正氣不足、外感寒濕，治療應當固本培元、活血通絡、清熱解毒、消腫止痛，通過綜合治療整體調節達到促進患者康復的目的［9］。

RA活動期可見關節局部紅腫、灼熱疼痛，關節周圍組織水腫，炎癥，局部壓痛，可有關節積液、活動受限或不能活動等；控制活動期發展是治療的關鍵［10］。本次實驗研究的藥物痹痛消膠囊是根據RA的內因、外因經臨床多年應用總結形成，方中青風藤祛風濕、通經絡，土茯苓除濕解毒、通利關節，為君；骨碎補強骨止痛、補骨脂溫腎固本、杜仲補腎強筋，為臣；當歸活血止痛、三七散瘀定痛、澤蘭化瘀消腫，為佐；甘草調和諸藥。諸藥合用，共奏祛風除濕、活血通絡、消腫止痛之功。臨床主要用于RA急性活動期取得較好療效。實驗結果表明痹痛消膠囊能顯著減輕類風濕性關節炎大鼠的足跖腫脹度，與臨床處方多年應用結果基本一致。

圖1　痹痛消膠囊對類風濕性關節炎大鼠關節組織病理學的影響 （HE，×200）Fig.1 Effects of Bitongxiao Capsules on joint tissue pathology of rats w ith rheumatoid arthritis（HE，× 200）

RA活動期CRP血清含有量顯著升高，在疾病的鑒別診斷和預后判斷方面均有一定的價值［11］。本實驗表明痹痛消膠囊明顯降低了類風濕性關節炎大鼠血清hsCRP含有量，提示痹痛消膠囊可較好改善類風濕性關節炎的預后情況。

在類風濕性關節炎患者中IL-1β含有量明顯升高，IL-1β參與炎癥、免疫反應，在形成RA的炎癥、黏附、新生血管生成過程中起著重要作用［12］。IL-1β可刺激滑液和軟骨細胞合成并釋放前列腺素E2（PGE2）和膠原酶，引起滑膜炎癥反應、軟骨基質崩解［13］，引起關節軟骨的破壞。另外，IL-1β還可以作用于內皮細胞，促進嗜中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的聚集，加重關節局部炎癥反應［14］。因此，抑制IL-1β對減輕炎癥反應、改善RA患者癥狀有重要意義。本實驗結果證明痹痛消膠囊能顯著降低RA大鼠血清中IL-1β含有量，提示痹痛消膠囊可能通過減少促炎細胞因子的產生從而減輕RA大鼠足腫脹炎癥反應來發揮抗RA的作用。

TNF-α是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子。TNF-α通過刺激血管內皮細胞表達黏附分子，刺激單核-吞噬細胞和其他細胞分泌趨化性細胞因子，引起白細胞在炎癥部位聚集［15］。我們實驗結果說明痹痛消膠囊能明顯減少RA大鼠血清中TNF-α含有量，表明這是其治療類風濕性關節炎有效途徑之一。

組織病理學觀察表明，痹痛消膠囊能明顯減輕關節出現的病理學改變，減少炎細胞浸潤，有利于改善RA患者的生活質量。

本項實驗初步研究了痹痛消膠囊抗類風濕性關節炎的作用，結果令人期待，值得進一步開發應用。

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Effect of Bitongxiao Capsules against rheum atoid arthritis and itsmechanism

CHEN Yu-xing1， ZUO Jun-cheng2， HUANG Xue-jun1， ZENG Xiao-hui1， YAO Nang1， HUANG Dan-e1， GAN Hai-ning1

（1.Guangdong Provincial Engineering Technology Research Institute of T.C.M，Guangzhou 510095，China；2.Guangzhou Universisty of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

AIM To observe the therapeutic effectof Bitongxiao Capsu1es（BTX）（SinomeniiCaulis，Smilacis glabrae Rhizoma，Drynariae Rhizoma，etc.）against rheumatoid arthritis（RA）and its mechanism of action. M ETHODS Seventy SD rats，except for ten rats as the contro1 group，the rest received SC Freund′s comp1ete adjuvant tomake the RA ratmode1.After two weeks，mode1 rats were administered BTX high，medium and 1ow dose.The anti-arthritic effects against RA were studied through observing the changes ofpaw swe11ing，high-sensitivity C-reactive protein（hsCRP），inter1eukin 1β（IL-1β），and tumor necrosis factorα（TNF-α）aftermedication.RESULTS BTX cou1d significant1y inhibit RA rats paw swe11ing，decrease the 1eve1s of hsCRP，IL-1β，and TNF-αin the serum of RA rats.CONCLUSION BTX has better therapeutic effect on RA and itsmechanism may be re1ated to the down-regu1ation of hsCRP，IL-1β，and TNF-α.

Bitongxiao Capsu1es（BTX）；rat；rheumatoid arthritis；C-reactive protein（hsCRP）；inter1eukin 1β（IL-1β）；tumor necrosis factorα（TNF-α）；paw swe11ing

R285.5

A

1001-1528（2016）06-1211-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.002

2015-08-31

廣東省科技計劃項目 （2011B032200016）

陳玉興 （1971—），男，主任中藥師，主要從事中藥藥理研究工作。Te1：（020）83576735，E-mai1：cyx89333@qq.com