桑酮堿對2型糖尿病腎病大鼠的保護作用及機制

馬 志， 孟慶海， 蒯美玉， 林 超， 張亞云， 孫 鑫， 姚 遠， 張啟春，2， 卞慧敏，2*（.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京20023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京20023）

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桑酮堿對2型糖尿病腎病大鼠的保護作用及機制

馬 志1， 孟慶海1， 蒯美玉1， 林 超1， 張亞云1， 孫 鑫1， 姚 遠1， 張啟春1，2， 卞慧敏1，2*
（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京210023）

目的 觀察桑酮堿 （桑葉總黃酮和總生物堿）對2型糖尿病腎病大鼠的腎功能和腎TGF-β1/Smad信號通路的影響。方法 以高脂聯合鏈脲佐菌素復制2型糖尿病腎病大鼠模型，成模后分為模型組，二甲雙胍組，桑酮堿低、中、高劑量組，另設正常空白組10只。灌胃給藥，12周后測定各組大鼠空腹血糖及24 h尿量，尿液中白蛋白、肌酐的含有量；取血測定血清肌酐、尿素氮，并計算肌酐清除率；HE染色觀察腎臟形態學的變化；Western bo1t方法測定TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、IV型膠原（CoIV）、E鈣黏蛋白（E-Ca）的蛋白表達水平；rea1 time PCR方法檢測Tgfb1、CoIV和E-Ca的mRNA表達水平。結果 桑酮堿給藥組能夠顯著降低糖尿病腎病大鼠空腹血糖、24 h尿量、尿白蛋白含有量及肌酐清除率，改善腎臟組織病理損傷，下調TGF-β1、p-Smad2/3、CoIV的表達，上調E-Ca表達。結論 桑酮堿能延緩2型糖尿病大鼠早期腎病并發癥的發生，其機制與調節腎臟TGF-β1/Smad信號通路有關。

桑酮堿；糖尿病腎病；腎小球濾過率；TGF-β1/Smad通路

糖尿病的發病率逐年升高，特別是2型糖尿病，占糖尿病患者總人數的90%以上，已經嚴重威脅人類的健康［1］。糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的并發癥之一，已成為導致終末期腎臟病的主要原因［2］。長期的慢性高血糖和血脂代謝障礙導致腎臟血流動力學異常，加速腎功能損害和功能障礙，在糖尿病腎病早期其臨床表現為超濾。研究發現，轉換生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在DN中被認為是關鍵性因子［3］。前期研究表明桑酮堿不僅能夠抑制葡萄糖及多糖的腸吸收，還有增加胰島素敏感性，改善脂肪代謝等作用［4］。本研究則利用2型糖尿病腎病大鼠模型探討桑酮堿的防治作用及其對TGF-β1/Smad信號通路的影響。

1　材料與儀器

1.1實驗動物 Sprague-Daw1ey大鼠，體質量200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證編號：11400700025240。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0042。

1.2藥物和試劑 桑酮堿 （鎮江吉貝爾藥業有限公司，批號141119）。桑酮堿是由桑葉中總黃酮和總生物堿按6∶1的比例配比而成。總黃酮以綠原酸為對照，比色法測定含有量為50.4% （主要是綠原酸及其異構體，其中還含少量蘆丁與異槲皮苷）。總生物堿中以1-脫氧野尻霉素、蕎麥堿、表蕎麥堿總和計50.6%。二甲雙胍 （北京中惠藥業有限公司，批號20130804）；葡萄糖試劑盒 （批號20130402147）、尿素氮試劑盒 （批號20140415）、白蛋白試劑盒 （批號20140427）、肌酐試劑盒 （批號20140404），均由南京建成生物研究所提供；水合氯醛 （南京寧試化學試劑有限公司，批號20131123）；BCA蛋白測定試劑盒 （上海依科賽生物制品有限公司，批號IM000-C021）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號1001270674）；TGF-β1抗體、CoⅣ抗體、Smad2/3抗體、p-Smad2/3抗體、E-Ca抗體均由美國Santa Cruze公司提供；二抗羊抗兔IgG-HRP（EnoGene公司）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司，批號#K1622）；Trizo1（美國Ambion公司，RET：15596026）；SYBE GREEN（德國Qiagen公司，Cat.NO.204054）；焦碳酸二乙酯水（BIO LINK，BL1005）。

1.3儀器 低速自動平衡離心機 （北京醫用離心機廠）；BioTek酶標儀（美國BioTek公司）；ULT1386-5-V42超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific［Ashevi11e］LLC）；164-5051 Western電泳儀（美國Bio-Rad公司）；5417R高速冷凍離心機 （德國Eppendof公司）；梯度熱循環儀 （美國App1ied Biosystems）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

2　方法

2.1動物模型復制、分組及給藥 將SD雄性大鼠150只隨機分為對照組10只、高脂飲食組 （140只）。高脂飲食組給予高脂飼料 （配方：10%豬油，20%糖，2.5%蛋黃，67.5%基礎飼料）喂養，空白組給予常規飼料喂養，8周后高脂飲食組大鼠一次性腹腔注射STZ（劑量為35 mg/kg）。模型組大鼠出現多尿癥狀后測定血糖，取血糖值＞16.7 mmo1/L的大鼠為成模大鼠。將成模大鼠隨機分為模型組，陽性對照二甲雙胍180 mg/kg組，桑酮堿73.5、147、294 mg/kg 3個劑量組，每組20只共100只，實驗中死亡大鼠不納入統計。每日一次灌胃給藥，連續12周，模型組和空白組灌胃等容積的水。

2.2標本收集 灌胃給藥12周后，代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量，3 000 r/10 min取上清測量尿液中尿素氮、肌酐、白蛋白的含有量。末次給藥后，動物禁食不禁水過夜，水合氯醛麻醉，頸總動脈取血，3 000 r/min離心10 min取血清測定葡萄糖、肌酐、尿素氮；切取左側腎皮質稱重，用于Western b1ot及rea1 time PCR檢測，剩余腎臟置于10%中性甲醛中固定用于病理檢查。

2.3腎組織病理形態學觀察 10%中性甲醛固定的腎組織常規脫水、包埋、4μm切片，分別行蘇木素伊紅染色 （HE染色）。光鏡下觀察腎臟形態學改變情況。根據病變程度分為0級無病變“-”，一級輕度 “+”，二級中度 “++”和三級重度 “+++”，評分分別記為0、1、2、3分。

2.4Western bo1t 檢測相關蛋白表達，提取腎臟皮質蛋白，每組3個樣本，BCA微量蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，取蛋白樣品50μg進行電泳，轉膜、封閉、加入一抗4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化酶標記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學發光試劑反應，曝光后掃描，用圖像分析軟件進行光密度分析。

2.5Rea1 time PCR檢測相關基因表達 Trizo1提取腎臟皮質總mRNA，每組6個樣本，鑒定其濃度及純度 （A260/A280介于1.8～2.2之間為最佳）。根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成250 ng/μL cDNA。利用SYBR GREEN檢測目的基因的表達。擴增條件：預變性，95℃，10min，共一個循環；變性15 s，退火30 s，延伸30 s，共45個循環；溶解程序，60℃，81個循環。引物序列見表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer information

2.6統計學方法 數據以SPSS 19.0軟件統計，采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，結果以±s表示，P＜0.05為有顯著差異。

3　結果

3.1桑酮堿對2型糖尿病大鼠血糖、24 h尿量、血清肌酐、尿肌酐、和肌酐清除率、尿白蛋白、血清尿素氮的影響 給藥前，模型組血糖明顯升高（P＜0.01），給藥組與模型組間血糖無顯著性差異（P＞0.05）。給藥12周后，模型大鼠血糖、尿白蛋白、尿素氮、24 h尿量、血清肌酐、尿肌酐、肌酐清除率明顯升高，與空白組比較，差異有高度顯著性 （P＜0.01）；各給藥組均能降低模型大鼠的血糖、24 h尿量、尿白蛋白、尿肌酐、血清肌酐和肌酐清除率，與模型組相比，差異均有高度顯著性 （P＜0.01）見表2～3。

表2　桑酮堿對給藥12周后DN大鼠血糖、尿白蛋白和血清尿素氮的影響 （±s）Tab.2 Effects of Sangtongjian m ixture on fasting blood glucose，urinary album in and BUN of serum in DN rats after 12 weeks（±s）

表2　桑酮堿對給藥12周后DN大鼠血糖、尿白蛋白和血清尿素氮的影響 （±s）Tab.2 Effects of Sangtongjian m ixture on fasting blood glucose，urinary album in and BUN of serum in DN rats after 12 weeks（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01

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表3　桑酮堿給藥12周后對DN大鼠24 h尿量、血肌酐，尿肌酐和肌酐清除率的影響 （±s）Tab.3 Effects of Sangtongjian m ixture on 24 h urine volume，serum creatinine，urine creatinine and creatinine clearance in DN rats（±s）

表3　桑酮堿給藥12周后對DN大鼠24 h尿量、血肌酐，尿肌酐和肌酐清除率的影響 （±s）Tab.3 Effects of Sangtongjian m ixture on 24 h urine volume，serum creatinine，urine creatinine and creatinine clearance in DN rats（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01

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3.2桑酮堿對2型糖尿病大鼠腎臟形態學變化的影響 HE染色顯示，正常組大鼠腎小球結構完整，未見腎小球肥大，腎小球基底膜系膜基質未見明顯異常改變，腎小管結構完整；模型組可見腎小球系膜及基底膜顯著增厚，與空白組比較有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。桑酮堿組病理改變程度明顯減輕，腎小球基底膜增厚程度顯著改善，腎小球系膜基質增生程度減輕，與模型組比較，有顯著性差異 （P＜0.05，P＜0.01），如圖1，病理評分見表4。

圖1　桑酮堿對2型糖尿病大鼠腎臟形態學的影響 （HE，×400）Fig.1 Effects of Sangtongjian m ixture on pathomorphology in kidney of DN rats（HE，×400）

表4　桑酮堿對DN大鼠腎臟病理評分的影響（±s，分）Tab.4 Effects of Sangtongjian m ixture on the grade of renal pathology in DN rats（±s，score）

表4　桑酮堿對DN大鼠腎臟病理評分的影響（±s，分）Tab.4 Effects of Sangtongjian m ixture on the grade of renal pathology in DN rats（±s，score）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　n　　　劑量/（mg·kg-1）系膜及基底膜增生腎小管變性壞死空白組　　10　　-　　0.00±0.00**　　0.00±0.00**模型組　　12　　-　　1.33±0.49　　2.33±0.49二甲雙胍組　　14　　180　　0.50±0.52**　　1.50±0.52**桑酮堿組　　12　　73.5　　0.92±0.29*　　1.92±0.29*桑酮堿組　　13　　147　　0.92±0.28*　　1.92±0.28*桑酮堿組　　12　　294　　0.50±0.52**　　1.50±0.52**

3.3桑酮堿對2型糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白的影響 根據Western bo1t結果顯示，12周后模型大鼠腎臟的TGF-β1、CoⅣ、p-Smad2/3的表達升高，E-Ca表達明顯降低。桑酮堿給藥后能夠不同程度的降低TGF-β1、CoⅣ、p-Smad2/3的蛋白表達，提高E-Ca的蛋白表達，與模型組比較，有顯著性差異 （P＜0.05，P＜0.01），如圖2。

圖2　桑酮堿對2型糖尿病大鼠腎臟TGF-β1、Smad、CoⅣ、E-Ca蛋白表達的影響（n=3）Fig.2 Expression of Sangtongjian m ixture on TGF-β1/Smad signal pathway and E-Ca，CoⅣprotein in renal of DN rats（n=3）

3.4桑酮堿對2型糖尿病大鼠腎臟Tgfb1、CoIV和E-Ca mRNA表達的影響 Rea1 time PCR結果顯示，模型組大鼠腎臟Tgfb1、CoIV的mRNA水平顯著升高，E-Ca的mRNA水平顯著降低，與空白組比較，有顯著性差異 （P＜0.05）。桑酮堿給藥組能夠不同程度的降低Tgfb1、CoIV的mRNA水平，提高E-Ca的mRNA水平，與模型組比較有顯著性（P＜0.05），如圖3。

圖3　桑酮堿對糖尿病腎病大鼠腎臟Tgfb1、E-Ca、CoIV m RNA的表達（n=6）Fig.3 Expression of Sangtongjian m ixture on Tgfb1，E-Ca and CoIV mRNA in renal of DN rats（n=6）

4　討論

用高脂飼料聯合低劑量STZ復制糖尿病大鼠模型，是應用最為廣泛的糖尿病動物模型，再經12周后逐步發展成腎病并發癥。該方法復制的糖尿病腎病大鼠模型與人類早期腎病的改變十分相似，如濾過率升高和蛋白尿增多，腎小球基底膜超微結構的改變以及腎小球系膜擴張［5］。在DN早期，除腎小球結構改變之外，更為顯著的是近端小管增生［6］，小管增生后加強重吸收，通過小管反饋使腎小球濾過率升高［7］。因此，在DN早期腎小球清除率升高，這與我們的實驗結果一致，即模型組大鼠與空白組比較肌酐清除率顯著升高。

研究表明，桑葉中含黃酮類，生物堿類，多糖和酚類化合物等，均具有不同程度的降糖作用［8］。根據本實驗結果發現桑酮堿能夠顯著降低DN大鼠血糖，進一步減輕由高糖導致的超濾，顯著降低肌酐清除率即腎小球濾過率，改善腎小球基底膜、系膜增生以及腎小管變性壞死情況，減輕大鼠腎臟代償作用，對腎臟起到保護作用。桑酮堿改善腎功能的作用與桑葉總生物堿中的特有成分1-脫氧野尻霉素有關，已有文獻報道1-脫氧野尻霉素能夠改善STZ誘導的糖尿病腎病大鼠的空腹和餐后血糖，改善受損的腎功能［9］。桑葉中的總黃酮有良好的降糖和抗氧化作用，還能夠激活肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR-γ和PPAR-α提高胰島素敏感性［10］。桑酮堿中黃酮與生物堿發揮多靶點多效應的作用，通過降低2型糖尿病大鼠血糖，進一步改善其腎功能。

小管間質纖維化是推動糖尿病腎病進程的主要因素之一［11-12］。在糖尿病腎病的狀態下發生的上皮間質轉換（epithe1ia1-mesenchyma1 transition，EMT）是小管間質纖維化的病理學基礎。在EMT過程中發生上皮細胞黏附分子如E-Ca蛋白的缺失，細胞失去黏附性，細胞骨架重塑并且發生形態學的改變進一步導致腎小管基底膜的破壞［13］。目前已經證實抑制TGF-β1的表達能夠延緩DN的病程［14］。在DN中，通過TGF-β1激活Smad信號通路參與腎臟纖維化，誘導EMT，促進膠原沉積，降低細胞黏附分子鈣黏蛋白E（E-Ca）水平［15-16］。TGF-β1也能夠通過Smad3和Smad2調節腎小球系膜細胞肥大、足細胞凋亡，加速腎小球硬化，加重由糖尿病以及其他原因導致的腎臟疾病［17-18］。在本實驗中，模型組大鼠的腎臟TGF-β1、p-Smad2/ 3、CoⅣ的表達水平升高，E-Ca的表達水平降低。在給予桑酮堿后，能夠不同程度的調節小管間質纖維化，改善腎小球系膜及基底膜增生的情況，與調節TGF-β1/Smad信號通路關系密切。

綜上所述，本實驗證實了桑酮堿能夠改善早期DN大鼠腎功能，其機制與調節TGF-β1/Smad信號通路有關。桑酮堿對實驗動物糖尿病及腎病并發癥保護作用的機制仍需要進一步研究。

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Effect of Sangtongjian m ixture on rats w ith type 2 diabetic nephropathy

MA Zhi1， MENG Qing-hai1， KUAIMei-yu1， LIN Chao1， ZHANG Ya-yun1， SUN Xin1， YAO Yuan1， ZHANG Qi-chun1，2， BIAN Hui-min1，2*

（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medicine，Nanjing 210023，China）

AIM To observe the effect of Sangtongjian mixture（tota1 f1avones and a1ka1oids from Morusalba）on rats with type 2 diabetic nephropathy（DN）and on TGF-β1/Smad pathway and its mechanism of action. M ETHODS SD rats induced by the combination of STZ and high fat dietwere estab1ished as the DN mode1.The DN rats were divided into mode1 group，metformin group，1ow-，midd1e-，and high-dose Sangtongjian mixture groups.Ten norma1 rats were set as the contro1group.Each treatment group was ora11y given the corresponding agents for twe1ve weeks.The 1eve1s of fasting b1ood g1ucose，24 h urine vo1ume，urinary a1bumin，urine creatinineweremeasured after treatments.Histopatho1ogy changes of kidney were eva1uated by HE staining.Protein 1eve1s of TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3，CoIV，and E-Ca were determined by Western b1ot；mRNA 1eve1s of Tgfb1、CoIV，E-Ca were eva1uated by rea1 time PCR.RESULTS Sangtongjian mixture group cou1d remarkab1y reduce the 1eve1s of fasting b1ood g1ucose，24 h urine vo1ume，urinary a1bumin，and urine creatinine.Furthermore，Sangtongjianmixture cou1d a1so attenuate the patho1ogica1changes of kidney，down-regu1ate the expression of TGF-β1，p-Smad2/3，CoIV and up-regu1ate the expression of E-Ca.CONCLUSION Sangtongjian mixture can de1ay the progression of ear1y 2 type DN，and theirmechanism of action might be associated with the regu1ation of TGF-β1/ Smad pathway in kidney.

Sangtongjian mixture；diabetic nephropathy；g1omeru1ar fi1tration rate；TGF-β1/Smad pathway

R966

A

1001-1528（2016）06-1215-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.003

2015-12-30

江蘇高校優勢學科建設工程資助項目 （PAPD）；國家自然科學基金 （81072985，81573529）

馬 志（1990—），女，碩士生，從事中藥心血管藥理的研究。Te1：18351895531，E-mai1：609438966@qq.com

卞慧敏 （1958—），女，研究員，博士生導師，從事中藥心血管藥理的研究。Te1：13851495212，E-mai1：hmbian@ sina.com