藜歡解郁膠囊的抗抑郁作用

劉 梅， 周海松， 許錦文， 李 萍， 奉建芳*（.上海中醫藥大學中藥產學研合作中心，上海00；.上海中醫藥大學穆拉德中藥現代化研究中心，上海00；.廣西中醫藥大學藥學院藥理教研室，廣西南寧5000；）

?

藜歡解郁膠囊的抗抑郁作用

劉 梅1， 周海松2，3， 許錦文2， 李 萍3， 奉建芳2*
（1.上海中醫藥大學中藥產學研合作中心，上海201203；2.上海中醫藥大學穆拉德中藥現代化研究中心，上海201203；3.廣西中醫藥大學藥學院藥理教研室，廣西南寧530001；）

目的 探討藜歡解郁膠囊 （蒺藜、合歡花、石菖蒲、甘草）抗抑郁的作用及其相關機制。方法 運用慢性應激性刺激加孤養法造成大鼠抑郁模型，觀察大鼠體質量、皮毛、飲食、排泄、強迫游泳不動時間和懸尾不動時間；用酶聯免疫吸附法 （ELISA法）觀察藜歡解郁膠囊對大鼠血清去甲腎上腺素 （NE）、多巴胺 （DA）、5-羥色胺 （5-HT）及皮質酮 （CORT）含有量的影響；用蛋白質印跡法觀察藜歡解郁膠囊對大鼠腦內海馬體腦源性神經營養因子 （BDNF）蛋白表達水平的影響。結果 與空白組比較，模型組動物造模后體質量增長緩慢 （P＜0.01），動物皮毛出現干枯、斑禿、不思飲食、不喜活動等情況。與模型組比較，各給藥組動物體質量增加明顯 （P＜0.05），飲食、皮毛等較正常。藜歡解郁膠囊低、高劑量組能明顯縮短大鼠的強迫游泳不動時間和懸尾不動時間 （P＜0.05或P＜0.01），升高抑郁大鼠血清中NE、DA、5-HT的含有量及腦內海馬BDNF蛋白的表達水平（P＜0.05或P＜0.01），降低血清中CORT的含有量 （P＜0.01）。結論 藜歡解郁膠囊有抗抑郁作用，其作用機制可能是通過提高單胺類神經遞質功能，抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，提高腦內海馬BDNF的表達水平，升高5-HT含有量，保護5-HT能神經元功能等途徑發揮抗抑郁作用。

藜歡解郁膠囊；抗抑郁；單胺類神經遞質；腦源性神經營養因子

抑郁癥是一種常見的精神障礙性疾病，以焦慮不安和情緒低落為主要特征，同時伴有思維遲鈍、注意力和學習記憶力下降、意志活動減弱或持續顯著的緊張不安伴自主神經功能興奮等癥狀［1-2］。

目前常見的抗抑郁藥物包括三環和四環類抗抑郁劑，單胺氧化酶（MAO）抑制劑，選擇性5-HT重吸收抑制劑，非典型抗抑郁藥 （SSRI）等。盡管其起效快、用藥量少，但長期服用都有一定的毒副作用。如臨床最常見的選擇性5-HT重吸收抑制劑鹽酸氟西汀 （百憂解），很多病人因其惡心、嘔吐或食欲減退等不良反應，而放棄治療，以致病情進一步惡化［3］。

中藥具有療效好、毒副作用低、較少的依賴性，以及不存在停藥后高復發或反跳作用等特點，近年來在抑郁癥的防治方面發揮了重要作用［4-5］。藜歡解郁膠囊來源于臨床驗方，前期的實驗表明該膠囊具有明確的抗抑郁的藥效。本文擬通過行為學觀察結合分子生物學相關方法初步探討其抗抑郁的藥效及相關作用機制。

1　材料

1.1儀器 FA1604型電子分析天平（上海上天精密儀器有限公司）；大鼠曠場反應箱 （自制，高25～30 cm，底邊長40 cm，內壁涂黑，底面平均分為25個小方格）；RE2000型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Tecan Infinite F50酶標儀（美國Dickson）；DL-P14洗片機（蘇州市德利影像設備科技有限公司）；Powerpac通用標準濕式轉膜儀（美國Bio-Rad）；Powerpac通用標準蛋白質電泳儀（美國Bio-Rad）；Centrifuge 5810R超速低溫離心機（德國Eppendorf）；JY92-ZD超聲波細胞粉碎機 （上海江萊生物科技有限公司）。

1.2 試劑與藥品 95%乙醇 （分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號20111228）；濃鹽酸 （國藥集團化學試劑有限公司，批號20100426）；甘油 （國藥集團化學試劑有限公司，批號F20110411）；Tween-20（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20100302）；甲醇 （國藥集團化學試劑有限公司，批號T20111214）；NaC1（國藥集團化學試劑有限公司，批號20110422）；考馬斯亮藍顯色劑 （美國Bio-Rad公司，批號5000006）；甲叉雙丙烯酰胺Bic（美國Amresco公司，批號0172）；SDS（美國Amresco公司，批號0227）；過硫酸銨AP（美國Amresco公司，批號A0486）；四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司，批號T8133）；溴酚藍（美國Amresco公司，批號0449）；硝酸纖維素膜 （上海依科賽生物制品有限公司，批號CS011-0001）；ECL化學發光顯色劑 （上海優寧維生物科技有限公司，批號WBKLS0500）；一抗BDNF（H-117）200μg/mL（美國Santa cruz公司，批號sc-20981）；丙烯酰胺Acr（美國Amresco公司，批號0341）；甘氨酸（美國Amresco公司，批號0167）；Tris base（美國Sigma公司，批號93349）；beta-巰基乙醇（美國Sigma公司，批號BY-12286）；二抗（山羊抗兔1gG）（上海碧云天生物技術研究所，批號A0208）；苯甲基磺酰氟PMSF（上海碧云天生物技術研究所，批號ST506）；RIPA裂解液 （上海碧云天生物技術研究所，批號P0013B）；Western b1ot Mark（上海杰瑞生物工程有限公司，批號SM0671）；Western b1ot內參GADPH（上海康成生物科技有限公司，批號KC-5G5）；大鼠皮質酮、5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺ELISA試劑盒 （上海藍基生物科技有限公司，批 號 分別 為E02C0066、E02H0202、E02N0013、E02D0002）；膠片 （柯達）；牛血清蛋白BSA；脫脂奶粉；顯影液和定影液；藜歡解郁膠囊 （由蒺藜、合歡花、石菖蒲、甘草4味藥組成，全方水提，提取液濃縮干燥加入木糖醇等輔料制粒，裝膠囊即得，上海中藥制藥技術有限公司制備，批號20120401）

1.3動物 Wistar大鼠（SPF級）體質量180～220 g，購自上海西普爾一必凱試驗動物有限公司 （合格證號SCXK［滬］2008-0016），動物飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心 （使用許可證號 SYXK［滬］2009-0069），標準環境：溫度 （22±1）℃，相對濕度 （60±5）%，人工光照，12 h明暗周期，自由攝食、飲水，開始實驗。

2　方法

2.1動物分組、給藥及造模 Wistar大鼠40只，雄性，適應性飼養1周后隨機分5組，每組8只，即空白對照組（生理鹽水NS，10 mL/kg），模型對照組 （NS，10 mL/ kg），陽性對照組 （鹽酸氟西汀膠囊，2.8 mg/kg），藜歡解郁膠囊高、低劑量組 （2.35、1.18 g/kg）。利用單籠飼養和長期不可預見性溫和應激建立慢性應激大鼠抑郁模型（8種應激因子按隨機分布表隨機安排到24 d中，平均每種刺激各2～3次，同一種刺激連續出現時間不超過2 d：①晝夜顛倒 （24 h）；②禁食 （24 h）；③潮濕墊料 （將200mL水加入有鋸木屑和大鼠糞便的籠底，24 h）；④鼠籠傾斜，搖晃 （速率1次/s 15min）；⑤40℃高溫環境 （5 min）；夾尾 （1min）；⑥4℃冰水游泳 （5min）；⑦陌生異常物品 （如塑料杯、木勺等）；⑧禁水24 h，除正常組外，各組大鼠均單籠飼養并按程序給予應激刺激。于造模后第3 d開始，每日上午9∶00～10∶00灌胃1次，給藥容量為10mL/kg，連續灌胃給藥21 d。

2.2指標測定

2.2.1藥物對大鼠體質量，飲食，毛發，排泄的影響 分別于給藥前，給藥后5 d，給藥后10 d，給藥后15 d，給藥后20 d稱量各組動物體質量。每天觀察動物飲食，排泄，毛發情況。

2.2.2大鼠強迫游泳實驗 第21天給藥后1 h進行實驗。實驗前大鼠訓練游泳10 min，24 h后測試：大鼠單只放入盛水容器中 ［40 cm×18 cm，水深18 cm；水溫 （23± 2）℃］，記錄5min內累計不動時間 （s）（所謂不動是指動物在水中停止掙扎，或動物呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面）。

2.2.3大鼠懸尾實驗 末次給藥后1 h進行實驗，將膠條粘在大鼠尾端2 cm處，懸掛在高于地面50 cm的架子上，使大鼠呈倒懸體位，每兩只大鼠間用擋板隔開。觀察6min，用秒表記錄后4min的累計懸尾不動時間。不動狀態以大鼠停止掙扎，身體呈靜止垂直倒懸狀態為準。

2.2.4藜歡解郁膠囊對大鼠血液中NE、DA、5-HT及CORT含有量的影響 于末次給藥后3 h從大鼠腹主動脈取血6～8 mL，置于試管中，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，分離血清，放置-20℃冰箱保存。采用ELISA法測定血清中NE、DA、5-HT、CORT的含有量。

2.2.5藜歡解郁膠囊對大鼠海馬BDNF蛋白表達水平的影響 大鼠處死后于冰上取腦，分離雙側海馬后置液氮中保存，采用Western b1ot法檢測BDNF蛋白含有量變化。

2.2.5.1蛋白濃度測定 從-80℃冰箱取出海馬組織（35～52 mg）/組，剪碎放入加有300μL RIPA的1.5 mL VP管，4℃，超聲粉碎3～5次，4℃放置1 h，移入離心管，4℃，12 000 r/min，離心10 min。取上清液，稀釋一定倍數后考馬斯亮藍法測蛋白濃度。利用下表測定A595值，做出標準曲線，計算出樣品的蛋白濃度。樣品與考馬斯亮藍溶液 （考馬斯亮藍∶水為1∶4）比例為1∶10。見表1［其中1～8代表不同的加樣孔，是標準品 （BSA）梯度稀釋后的編號。BSA的原液質量濃度為0.5mg/mL］。

表1　考馬斯亮藍法蛋白質量濃度

2.2.5.2蛋白質免疫印跡分析 ①稀釋后的上清液加入等體積2×電泳上樣緩沖液，95℃水浴變性5 min，-80℃凍存備用。②80μg組織總蛋白在15%和4%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離至溴酚藍到達凝膠即止。③將凝膠濕法轉印至硝酸纖維素膜 （NC膜）。④取出NC膜，浸于含5%脫脂奶粉的Tris緩沖生理鹽水（Tris buffered sa1ine，TBS）中室溫輕搖封閉1 h，用含0.05%的吐溫20的TBS（TBST）緩沖液漂洗干凈，浸入含5%脫脂奶粉的TBST稀釋的一抗（兔抗人BDNF抗體1∶500），GAPDH抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜。⑤用TBST漂洗NC膜3次（每次8 min），在TBST稀釋的HRP標記的二抗溶液（山羊抗兔IgG 1∶4 000）中室溫孵浴1 h。⑥NC膜用TBST緩沖液漂洗3次，用ECL檢測試劑盒顯色（滴加A+B混合液，每張膜約200μL），曝光、顯影和定影，膠片經圖像分析軟件測定灰度值。以GAPDH為內參，用相對值（BDNF/GAPDF）表示各實驗組蛋白表達水平。

3　實驗結果

3.1藥物對大鼠體質量、飲食、毛發、排泄的影響 與空白組比較，模型組動物造模后體質量增長緩慢 （P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組動物體質量增加明顯（P＜0.05，P＜0.01）。造模后模型組動物皮毛出現干枯、起球、脫落現象，身體出現斑禿，且不思飲食，蜷縮在籠子一側，不喜活動，大便干枯，量少，小便發黃。而給藥組情況有明顯改善，飲食正常，毛發脫落減少，皮毛較光滑油亮，大小便基本正常，結果見表2。

表2　藜歡解郁膠囊對大鼠體質量的影響 （n=8，±s）

表2　藜歡解郁膠囊對大鼠體質量的影響 （n=8，±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

?

3.2大鼠強迫游泳實驗 造模后，模型組不動時間延長，與空白組進行比較，有顯著性差異 （P＜0.05），說明模型組造模成功。與模型組比較，藜歡解郁膠囊低、高劑量組均可明顯縮短大鼠強迫游泳不動時間 （P＜0.05，P＜0.01）。與鹽酸氟西汀組比較，在給藥后無顯著性差異（P＞0.05）。這說明藜歡解郁膠囊可顯著對抗大鼠因慢性應激性刺激造成的抑郁癥狀，結果見表3。

表3　藜歡解郁膠囊對強迫游泳大鼠不動時間的影響 （n= 8，±s）

表3　藜歡解郁膠囊對強迫游泳大鼠不動時間的影響 （n= 8，±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

?

3.3大鼠懸尾實驗 造模后，模型組不動時間延長，與空白組有顯著性差異 （P＜0.05）；與模型組相比，藜歡解郁膠囊低、高劑量組均可以縮短大鼠不動時間，其中高劑量組可顯著性縮短大鼠不動時間 （P＜0.01），可明顯改善大鼠因慢性應激性刺激造成的抑郁癥狀，結果見表4。

表4　藜歡解郁膠囊對懸尾大鼠不動時間的影響 （n=8，±s）

表4　藜歡解郁膠囊對懸尾大鼠不動時間的影響 （n=8，±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01

?

3.4藜歡解郁膠囊對大鼠血液中NE、DA、5-HT及CORT含有量的影響 與空白組比較，模型組能明顯降低大鼠血清中NE、DA、5-HT的含有量，升高血清中CORT的含有量 （P＜0.01），說明造模成功。與模型組比較，鹽酸氟西汀組及藜歡解郁膠囊組均能明顯升高大鼠血清中NE、DA、5-HT的含有量，并且降低血清中CORT的含有量（P＜0.05，P＜0.01），結果見表5。

表5　藜歡解郁膠囊對大鼠血清中NE、DA、5-HT、CORT含有量的影響（n=8，±s）

表5　藜歡解郁膠囊對大鼠血清中NE、DA、5-HT、CORT含有量的影響（n=8，±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

?

3.5藜歡解郁膠囊對大鼠海馬BDNF蛋白表達水平的影響

與空白組比較，模型組能明顯降低大鼠海馬BDNF蛋白表達 （P＜0.01）。與模型組比較，鹽酸氟西汀組和藜歡解郁膠囊組均能明顯增強大鼠海馬BDNF蛋白表達 （P＜0.01），結果見表6、圖1。

4　討論

表6　藜歡解郁膠囊對大鼠海馬BDNF蛋白表達水平的影響（n=4，±s）

表6　藜歡解郁膠囊對大鼠海馬BDNF蛋白表達水平的影響（n=4，±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

?

抑郁癥的發生與體內神經內分泌系統紊亂有關。環境變化 （如慢性應激等）是誘致體內激素水平變化的主要因素，主要影響腦內邊緣系統-下丘腦-垂體-腎上腺素軸的激素水平。抑郁癥模型動物的行為改變與內源性抑郁癥癥狀相似，包括活動能力下降、腦內單胺神經遞質的變化及下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進引發的高皮質酮血癥等［6-7］。中樞單胺類神經遞質如NE、DA、5-HT等含有量減少是抑郁癥的病理機制之一，有研究人員對重度抑郁癥的患者進行尸檢，發現患者腦內單胺神經遞質的含有量明顯低于正常人。因此，提高中樞神經系統單胺類神經遞質功能或提高它們在神經突觸間隙的濃度的藥物都有改善情緒或治療抑郁癥狀的作用。

圖1　藜歡解郁膠囊對大鼠海馬BDNF蛋白的表達

海馬是邊緣系統的重要組成部分，對情緒、學習和記憶、行為等調節起重要作用，也是應激反應的高位調節中樞。慢性應激可損害海馬，引起其結構和功能的變化［5］。BDNF、神經生長因子（NGF）、神經營養因子-3（NT-3）等多種神經營養因子合成的缺乏可能造成海馬神經元的損失和凋亡［6-7］。BDNF的缺乏可導致海馬發生病理變化從而引起抑郁癥，BDNF表達水平的下降參與了抑郁癥的某些病理生理過程。當機體處于長期的應激或慢性神經心理應激狀態時，機體處于失代償階段，經過一系列中間因子的作用，BDNF表達下調，導致神經細胞凋亡或死亡［8-10］。因而有學說認為海馬體神經元產生的BDNF缺失和功能降低會構成抑郁行為，抗抑郁藥能提高腦的BDNF水平，BDNF通過激活其高親和力受體TrkB對神經元的生存及活動起重要調節作用［11-12］，BDNF的表達增加有利于神經元的生存，提高海馬突觸可塑性，是各種抗抑郁劑治療的共同作用機制。此外，BDNF還與單胺系統密切相關，BDNF對5-HT神經元具有神經保護作用，而BDNF的表達同時也受5-HT調節［13-15］。當處于應激狀態時，機體可產生一系列反應來進行調節以便最終適應應激狀態，其中包括升高腦內BDNF的表達水平。當應激持續作用于機體時，BDNF水平將持續升高，最終通過進一步發展后將破壞BDNF與5-HT能神經元功能的動態平衡，產生神經性毒性并導致海馬神經元的進一步凋亡，進而出現腦內海馬BDNF表達持續減少，最終導致腦內BDNF水平下降、5-HT及5-HT能神經元功能的減弱，最終發展成為一種新的病態平衡［16-18］。

本實驗結果得知，藜歡解郁低、高劑量組均可改善抑郁大鼠的體質量、飲食、毛發、排泄等情況，明顯縮短大鼠強迫游泳不動時間和大鼠懸尾不動時間，顯著增加大鼠體內單胺遞質NE、DA、5-HT等的含有量，明顯降低CORT的含有量，顯著增強腦內海馬體BDNF蛋白表達水平，提示藜歡解郁膠囊具有抗抑郁作用，其作用機制可能是通過提高單胺類神經遞質功能，抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，提高腦內海馬BDNF的表達水平，升高5-HT含有量，保護5-HT能神經元功能等途徑發揮抗抑郁作用。

［1］Rona1d S.Duman.Neurona1 damage and protection in the pathophysio1ogy and treatment of psychiatric i11ness：stress and depression［J］.Dialogues Clin Neurosci，2009，11（3）：239-255.

［2］Kercher A J，Rapee R M，Schniering C A.Neuroticism，1ife events and negative thoughts in the deve1opmentof depression in ado1escent gir1s［J］.J Abnorm Child Psycho，2009，37（7）：903-915.

［3］Midde1dorp CM，LandtM C，Med1and SE，etal.Anxiety and depression in chi1dren and adu1ts：inf1uence of serotonergic and neurotrophic genes［J］.Genes Brain Behav，2010，9（7）：808-816.

［4］葉建飛，林 勇，夏江明.舒肝解郁膠囊與舍曲林治療老年抑郁癥的對照研究［J］.中成藥，2014，36（5）：1104-1105.

［5］盧燕婉，呂海東，秦東香.烏靈膠囊治療輕度抑郁癥的臨床研究［J］.中成藥雜志，2010，32（6）：1083-1084.

［6］Ladea M，Bran M.Brain derived neurotrophic factor（BDNF）1eve1s in depressed women treated with open-1abe1escita1opram［J］.Psychiatr Danub，2013，25（2）：128-32.

［7］Erickson K I，Mi11er D L，Roeck1ein K A.The aging hippocampus：interactions between exercise，depression，and BDNF［J］. Neuroscientist，2012，18（1）：82-97.

［8］Lee Y，Kim J，Jang S，et al.Administration of phytoceramide enhancesmemory and upregu1ates the expression of pCREB and BDNF in hippocampus of mice［J］.Biomol Ther（Seoul），2013，21（3）：229-233.

［9］Ristevska-Dimitrovska G，Shishkov R，Gerazova V P，et al. Different serum BDNF 1eve1s in depression：resu1ts from BDNF studies in FYR Macedonia and Bu1garia［J］.Psychiatr Danub，2013，25（2）：123-127.

［10］Hauser SR，Getachew B，Tay1or R E，et al.A1coho1 induced depressive-1ike behavior is associated with a reduction in hippocampa1BDNF［J］.Pharmacol Biochem Behav，2011，100（2）：253-258.

［11］Yu H，Chen Z Y.The ro1e of BDNF in depression on the basis of its 1ocation in the neura1 circuitry［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32（1）：3-11

［12］Getachew B，Hauser S R，Tay1or R E.A1coho1-induced depressive-1ike behavior is associated with cortica1norepinephrine reduction［J］.Pharmacol Biochem Behav，2010，96（4）：395-401

［13］Piccinni A，De1Debbio A，Medda P，et al.P1asma Brain-Derived Neurotrophic Factor in treatment-resistant depressed patients receiving e1ectroconvu1sive therapy［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2009，19（5）：349-355.

［14］Fernandes B，Gama C S，Massuda R，et al.Serum brain-derived neurotrophic factor（BDNF）is not associated with response to e1ectroconvu1sive therapy（ECT）：a pi1ot study in drug resistant depressed patients［J］.Neurosci Lett，2009，453（3）：195-198.

［15］Hu Y，Yu X，Yang F，et al.The 1eve1 of serum brain-derived neurotrophic factor is associated with the therapeutic effi-cacy of modified e1ectroconvu1sive therapy in Chinese patients with depression［J］.JECT，2010，26（2）：121-125.

［16］Kim J，Ga1e K，Kondratyev A.Effects of repeated minima1e-1ectroshock seizures on NGF，BDNF and FGF-2 protein in the rat brain during postnata1deve1opment［J］.Int JDev Neurosci，2010，28（3）：227-232.

［17］Ngoupaye G T，Ngo Bum E，Danie1sW M.Antidepressant-1ike effects of the aqueousmacerate of the bu1b of Gladiolus dalenii Van Gee1（Iridaceae）in a ratmode1of epi1epsy-associated depression［J］.BMC Complement Altern Med，2013，13：272.［18］Gardier A M.Antidepressant activity：contribution of brain microdia1ysis in knock-outmice to the understanding of BDNF/5-HT transporter/5-HT autoreceptor interactions［J］.Front Pharmacol，2013，8（4）：98-140.

R285.5

B

1001-1528（2016）06-1383-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.038

2015-05-27

上海市科學技術委員會中藥現代化項目 （10DZ1971800）；上海市教育委員會預算內項目 （2011JW26）

劉梅 （1978—），女，碩士，副研究員，主要從事中藥新藥研發及新劑型的研究。Te1：（021）51323105，E-mai1：1mcao@ hotmai1.com

奉建芳 （1966—），男，博士，研究員，主要從事中藥新劑型與新制劑的研究。Te1：（021）51323104，E-mai1：fengjianfang @vip.163.com