雷公藤內酯醇對佐劑性關節炎大鼠脊髓背根神經節中MCP-1及CCR2表達的影響

張旭東， 楊若松， 陳 偉， 蔣雯雯， 韋登明， 林 榮*（1.寧波大學醫學院病理學與病原生物學系，浙江 寧波315211；2.寧波市行為神經科學重點實驗室，浙江寧波315211）

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雷公藤內酯醇對佐劑性關節炎大鼠脊髓背根神經節中MCP-1及CCR2表達的影響

張旭東1，2， 楊若松1，2， 陳 偉1，2， 蔣雯雯1，2， 韋登明1，2， 林 榮1，2*
（1.寧波大學醫學院病理學與病原生物學系，浙江 寧波315211；2.寧波市行為神經科學重點實驗室，浙江寧波315211）

目的 通過檢測不同劑量雷公藤內酯醇（tripto1ide，TP）對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠的鎮痛效果及其對腰5（L5）脊髓背根神經節中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及趨化因子受體-2（chemokine receptor2，CCR2）表達的影響，旨在探討雷公藤內酯醇對類風濕性關節炎可能的鎮痛機制。方法 50只SD大鼠隨機分成5組即正常組，模型組，雷公藤內酯醇低、中、高劑量治療組。模型組及治療組右后足跖皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑造模，正常組注射0.1 mL生理鹽水對照。造模后2周，治療組大鼠采取不同劑量雷公藤內酯醇腹腔注射給藥治療（低劑量治療組0.1 mg/kg，中劑量治療組0.2 mg/kg，高劑量治療組0.4 mg/kg），每天1次，共9 d。于造模前，造模后14 d，給藥后9 d進行熱痛閾的測定，用免疫組化檢測腰5脊髓背根神經節 （dorsa1 root gang1ia，DRG）中MCP-1、CCR2的表達變化情況。結果 模型組大鼠熱痛閾顯著低于正常組（P＜0.01），經過雷公藤內酯醇治療后，各治療組熱痛閾均顯著高于模型組 （P＜0.05，P＜0.01）；免疫組化結果表明模型組DRG中MCP-1及CCR2陽性表達水平較正常組顯著升高（P＜0.01），其中雷公藤內酯醇低劑量治療組大鼠L5DRG中只有MCP-1陽性表達水平顯著低于模型組（P＜0.01），而雷公藤內酯醇中高劑量治療組大鼠L5DRG中MCP-1、CCR2陽性表達水平均顯著低于模型組 （P＜0.01）。結論 雷公藤內酯醇對佐劑性關節炎具有良好鎮痛作用；雷公藤內酯醇可抑制AA大鼠DRG中MCP-1及CCR2的表達，這可能是雷公藤內酯醇產生鎮痛作用機制之一。

佐劑性關節炎；雷公藤內酯醇；鎮痛；背根神經節；趨化因子

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自體免疫性疾病，常伴有劇烈疼痛，嚴重降低患者的生存質量，止痛是治療RA的重要環節，也是判定該病療效的標準之一［1］。而近年來發現MCP-1及CCR2在神經病理性疼痛和炎性痛發生發展中有重要的作用［2-4］。脊髓是疼痛相關信息傳遞及整合的初級中樞，其背根神經節神經元的MCP-1對外周痛感受器的功能強弱有影響，MCP-1與慢性疼痛的發生發展密切相關［5-7］。雷公藤在臨床上有確切的鎮痛療效，而雷公藤內酯醇對佐劑性關節炎大鼠鎮痛機制與大鼠脊髓背根神經節中趨化因子MCP-1及其受體CCR2表達的關系尚未見報道。

本實驗通過建立AA大鼠模型，給予不同劑量雷公藤內酯醇治療，以熱痛閾、腰5（L5）節段脊髓 DRG中MCP-1及其受體CCR2的表達為檢測指標，旨在探討不同劑量雷公藤內酯醇對AA大鼠脊髓DRG中MCP-1和CCR2的影響，為雷公藤制劑的臨床鎮痛提供一定的理論依據。

1　材料與儀器

1.1實驗動物與試劑 SD大鼠50只，雌雄各半，體質量約180～220g，寧波大學實驗動物中心代購，合格證號0102013；雷公藤內酯醇由上海科衛醫療技術研究所提供（純度為99.9%，批號20130111），用4%丙二醇溶液加熱溶解；完全弗氏佐劑 （美國Sigma公司）；戊巴比妥鈉 （德國Merck公司）；SABC免疫組化染色試劑盒，MCP-1、CCR2多克隆抗體原液，DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2主要儀器 ZH-LUO/B鼠尾測痛儀（正華生物儀器設備有限公司）；BM-Ⅶ包埋機 （宏業醫用儀器有限公司）；HM-325石蠟切片機（德國LEICA公司）；CX40生物顯微鏡 （日本O1ympus公司）；JD801形態學圖像分析系統（江蘇捷達科技發展有限公司）。

2　方法

2.1動物分組及模型制備 大鼠喂養7 d后隨機分成5組：正常組，模型組，雷公藤內酯醇低、中、高劑量治療組。大鼠麻醉消毒后，模型組和治療組大鼠在右后足跖皮內注射0.1mL完全弗氏佐劑誘導AA大鼠模型，正常組則在相應部位注射等量生理鹽水作為對照，繼發關節炎的出現標志造模成功，約要2周。造模14 d后，治療組大鼠分別按低、中、高劑量 （0.1、0.2、0.4 mg/kg）腹腔注射雷公藤內酯醇溶液進行治療，每日1次，連續9 d，而正常組和模型組大鼠腹腔注射等體積4%丙二醇溶液作為對照。

2.2熱痛閾測定 使用光致熱鼠尾測痛儀，對造模前，造模14 d，治療9 d的大鼠進行熱痛閾測定。將鼠尾測痛儀調到55℃，將鼠尾放入凹槽內，于距鼠尾尖約0.5 cm處照射致痛，記錄大鼠由照射開始到鼠尾甩動的時間，連續測3次，間隔5m in以上，取平均值作為痛閾。

2.3組織病理學檢查 給藥后9 d，將實驗動物麻醉后左心灌注處死，取踝關節，腰5節段脊髓DRG放入中性固定液中固定。固定后的踝關節流水沖洗后，經脫鈣液脫鈣，梯度酒精脫水，透明，浸蠟后，包埋，做HE染色；而DRG則按照說明書進行免疫組化測定趨化因子MCP-1及其受體CCR2的表達，每張切片鏡下400倍下選擇4個視野由JD801形態學圖像分析系統測量陽性產物的積分光密度（IOD），并進行統計分析。2.4 統計學分析 結果用±s表示，采用SPSS18.0軟件進行重復測量資料的單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

3　結果

3.1不同劑量雷公藤內酯醇對AA大鼠熱痛閾的影響 結果見表1，造模前各組大鼠熱痛閾無顯著差異 （P＞0.05）。造模14 d時，正常組大鼠熱痛閾顯著高于模型組 （P＜0.01）；雷公藤內酯醇治療9 d后，低、中、高劑量治療組熱痛閾均高于模型組 （P＜0.05，P＜0.01）；且中劑量治療組療效較低劑量治療組明顯 （P＜0.05），高劑量治療組與低、中劑量治療組相比，熱痛閾提高更為顯著 （P＜0.01）。由此可以推測低、中、高劑量的雷公藤內酯醇治療AA大鼠9 d后，均可顯著提高熱AA大鼠的痛閾，且呈一定的量效關系。

表1　雷公藤內酯醇對各組大鼠熱痛閾變化的影響 （±s，n=10）

表1　雷公藤內酯醇對各組大鼠熱痛閾變化的影響 （±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TP低劑量治療組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TP中劑量治療組比較，△△P＜0.01

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3.2不同劑量雷公藤內酯醇對AA大鼠踝關節滑膜組織病理學影響 圖1所示為各組大鼠踝關節的HE染色圖片，其中正常組大鼠踝關節腔邊緣清晰，關節軟骨表面光滑，未見滑膜組織增生以及炎性細胞浸潤，結構正常；模型組大鼠踝關節出現滑膜增生，滑膜細胞數量增多，同時伴有大量炎性細胞浸潤；經雷公藤內酯醇治療后，治療組大鼠滑膜組織的炎性細胞浸潤較模型組有明顯減少，炎癥反應程度逐漸減輕，隨著雷公藤內酯醇治療劑量增加，效果愈加明顯。

3.3不同劑量雷公藤內酯醇對AA大鼠DRG中MCP-1及其受體CCR2的影響 雷公藤內酯醇治療9 d后，大鼠L5DRG中模型組MCP-1及CCR2免疫陽性積分光密度顯著高于正常組（P＜0.01），低劑量治療組MCP-1免疫組化陽性產物積分光密度較模型組顯著降低 （P＜0.01），而中、高劑量治療組MCP-1及CCR2免疫組化陽性產物積分光密度均較模型組顯著下降 （P＜0.01），趨勢呈一定的量效關系。結果見表2～3。

表2　各組大鼠L5 DRG中MCP-1的表達（±s）

表2　各組大鼠L5 DRG中MCP-1的表達（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

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4　討論

谷氨酸參與痛覺信息的傳遞，是介導痛覺信息傳遞最主要的神經遞質之一，NO是谷氨酸興奮作用的細胞內信使，介導谷氨酸的神經毒性，同時又與多種遞質相互作用，加強疼痛信號在脊髓后角的調制，產生病理性疼痛［8］，誘導型一氧化氮合酶 （iNOS）是一種生成NO的限速酶，但iNOS基因一般不表達，只有在如腫瘤壞死因子、白介素-1等內毒素和多種細胞因子刺激下，才會轉錄翻譯和表達。NMDAR是谷氨酸受體的一個類型，屬于離子型受體。關節炎患者的外周損傷釋放緩激肽等物質使感受器激活，膜去極化，而炎性介質如NO、PG等進一步加強外周感受器的敏化狀態，使感受器持續產生傷害性沖動傳入脊髓，致使脊髓神經元興奮，大量釋放P物質 （SP）和谷氨酸。谷氨酸可直接激活突觸后膜的NMDAR導致Ca2+內流激活蛋白激酶C（PKC），激活的PKC使細胞膜磷酸化NMDAR，提高NMDAR興奮性并增加Ca2+內流；而NMDAR的激活與Ca2+濃度的升高又會使PKC活性增強，從而形成正反饋使疼痛持續存在。NMDAR1激活后還可調節SP、谷氨酸等神經遞質的突觸前釋放，表明NMDAR1可能參與了中樞敏化的形成［9］。

圖1　各組大鼠踝關節HE染色圖 （×100）

表3　各組大鼠L5 DRG中CCR2的表達（±s）

表3　各組大鼠L5 DRG中CCR2的表達（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

陽性產物積分光密度正常組　10　30.9±9.49組別　n *模型組　10　49.2±16.01 TP低劑量治療組　10　41.1±21.07 TP中劑量治療組　10　31.3±9.85*TP高劑量治療組　10　19.0±6.99*

本實驗室既往的研究［10-11］表明 AA大鼠脊髓背角和DRG中iNOS、SP、IL-1β、TNF-α、NMDAR1表達較正常對照組顯著上調，而雷公藤內酯醇對這些細胞因子表達的抑制作用可能是雷公藤內酯醇的鎮痛作用機制之一。這顯示雷公藤內酯醇具有多靶點作用的特點。

MCP-1及其受體CCR2是近年來較為熱門的趨化因子，周圍組織炎癥或神經損傷后DRG中神經元可大量分泌MCP-1，而周圍小膠質細胞上的CCR2受體與之結合后通過信號傳遞傳導通路刺激小膠質細胞迅速活化增殖并釋放出大量細胞因子，進一步引發星形膠質細胞的活化。小膠質細胞和星形膠質細胞活化后相互激活進而產生協同作用，釋放多種致痛物質如iNOS、SP引發神經元興奮性升高的同時，又降低神經元的興奮閾值，以至于正常時不能產生疼痛的低強度刺激也可致痛從而形成中樞敏化現象，加上疼痛的正反饋的共同作用使慢性痛持續存在［3，12-14］。

本實驗結果顯示，造模14 d時，正常組大鼠熱痛閾顯著高于模型組；而免疫組化結果顯示模型組大鼠DRG中MCP-1及CCR2陽性產物表達水平均顯著高于正常組，提示在AA大鼠造模時，關節的炎癥反應使感受器受到外界刺激后疼痛信息傳入增加，導致DRG神經元內MCP-1及CCR2表達增加，可能參與了AA大鼠關節痛的發生。經雷公藤內酯醇治療后，低、中、高劑量治療組大鼠MCP-1及CCR2的陽性表達均有顯著下降，且呈一定的量效關系的趨勢。分析這一結果產生的可能原因為：在關節炎形成后，雷公藤內酯醇抑制了關節局部炎癥反應及DRG中MCP-1、CCR2的表達，使外界刺激后疼痛信息傳入也相應減少而發揮鎮痛作用。

綜上所述，雷公藤內酯醇的鎮痛機制可能與其抑制背根神經節DRG中MCP-1及CCR2的表達有關，具體的分子機制還有待進一步探究加以明確。

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1390-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.040

2015-09-08

寧波市自然科學基金項目 （2014A610247）；寧波大學學科項目 （XKL14D2102）

張旭東（1991—），男，碩士生，從事類風濕性關節炎防治機理的研究。E-mai1：zhangxudong9134@sina.cn

林 榮 （1978—），男，實驗師，從事類風濕性關節炎防治機理的研究。Te1：（0574）87609590，E-mai1：1inrong@nbu. edu.cn