黃連多糖提取工藝的優(yōu)化及其體外抗氧化作用

姜 爽， 李 璐， 王星云， 邱麗敏， 包 楊*（.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春307；.吉林省前衛(wèi)醫(yī)院，吉林長春300）

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黃連多糖提取工藝的優(yōu)化及其體外抗氧化作用

姜 爽1， 李 璐1， 王星云1， 邱麗敏2， 包 楊1*
（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.吉林省前衛(wèi)醫(yī)院，吉林長春130021）

目的 探討黃連多糖的最佳提取工藝及其體外抗氧化作用。方法 單因素試驗(yàn)考察不同提取及樣品處理方法對黃連多糖得率的影響，正交試驗(yàn)確定最佳提取條件，測定其對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除作用。結(jié)果 最佳提取工藝為粉碎過40目篩，回流提取，料液比、提取溫度、時(shí)間及次數(shù)分別為1∶10、100℃、45 min和3次，平均得率為1.52%。同時(shí)，黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用。結(jié)論 該方法操作簡便，條件溫和，適合推廣。

黃連多糖；提取工藝；體外抗氧化作用；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；超氧陰離子自由基；羥自由基；DPPH自由基

黃連Coptis chinensis應(yīng)用歷史悠久，為傳統(tǒng)中藥材，藥理作用廣泛，涉及抗癌、抗炎、抗糖尿病等［1-3］，而黃連多糖為其活性成分之一，主要具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抗菌和抗糖尿病等活性［4-6］。本課題組前期證實(shí)，其具有降低糖尿病模型小鼠的血糖水平以及改善血脂代謝紊亂的作用［7］，還發(fā)現(xiàn)其降糖機(jī)制與提高模型小鼠抗氧化物酶活性、降低脂質(zhì)過氧化物含有量等密切相關(guān)［8］。為了更好地開發(fā)和利用黃連多糖，本實(shí)驗(yàn)對該成分提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對其體外抗氧化作用也做了進(jìn)一步探討。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 黃連藥材購自本地市場，經(jīng)北華大學(xué)生藥教研室鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch的根莖。D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖購自中國食品藥品檢定研究院；DPPH購自美國Sigma公司。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。2550紫外-可見分光光度計(jì) （日本島津國際貿(mào)易上海有限公司）；藥材粉碎機(jī) （濟(jì)南天方機(jī)械有限公司）；真空干燥箱 （南京帕源機(jī)械設(shè)備有限公司）；恒溫水浴箱 （北京醫(yī)用設(shè)備廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多糖含有量標(biāo)準(zhǔn)曲線 用76%稀硫酸溶解50.00 mg蒽酮，并定容至50mL量瓶中備用。稱取干燥至恒重的葡萄糖25.00 mg，加蒸餾水定容至25 mL，配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，蒸餾水定容至25 mL，分別吸取1 mL，加5mL蒽酮試液，迅速放入冰水浴中搖勻，再置于水浴中煮沸10min，冷卻，于624 nm波長處測定吸光度，蒸餾水作為空白對照。以吸光度為縱坐標(biāo) （y）、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）回歸，得回歸方程y=0.004 7x+0.032 5（r=0.999 1），線性范圍20～120μg/mL。

1.2.2多糖得率測定 按照 “1.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，根據(jù)下述公式計(jì)算多糖得率。

1.2.3不同提取方法比較 取黃連藥材5.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，然后加入50 mL蒸餾水，分別采用超聲提取法 （1 h）、回流提取法 （1 h）和冷浸提取法 （室溫下浸泡過夜）提取。將所得濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，測定多糖含有量和得率。

1.2.4不同樣品處理方法比較 采用回流提取法，以蒸餾水為提取溶劑，考察藥材不同粒度 （過100目篩、40目篩和未粉碎）對多糖提取率的影響。稱取樣品各5.0 g，加入50 mL蒸餾水，回流取1 h，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，測定多糖含有量和得率。

1.2.5正交試驗(yàn) 取干燥至恒重的黃連藥材適量，粉碎后過40目篩，稱取5.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加50mL蒸餾水。按照表1條件分別進(jìn)行提取，濾液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，加水至刻度，測定多糖含有量和得率。

表1　因素水平

1.2.6 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證 按正交試驗(yàn)所得工藝條件提取3次，計(jì)算平均得率，考察其可靠性。

1.2.7黃連多糖對超氧陰離子自由基清除作用的測定 吸取不同質(zhì)量濃度的黃連多糖樣品液1 mL，依次加入四唑氮藍(lán)（0.078 mo1/L）和還原型輔酶Ⅰ（0.468 mo1/L）各1 mL，最后加入吩嗪硫酸甲酯（0.06 mo1/L）0.4 mL，反應(yīng)后室溫下靜置5m in，在560 nm波長處測定吸光度 （A），蒸餾水取代樣品液作為陰性對照，計(jì)算清除率，公式為清除率=（1-A樣品/A陰性對照）×100%

1.2.8黃連多糖對羥自由基清除作用的測定 吸取不同質(zhì)量濃度的黃連多糖樣品液1 mL，依次加入pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmo1/L FeC13和0.1 mmo1/L EDTA）1.5 mL和20 mmo1/L H2O20.35 mL，37℃下放置40 min后終止反應(yīng)，在532 nm波長處測定吸光度，蒸餾水取代樣品液作為陰性對照，計(jì)算清除率，公式同“1.2.7”項(xiàng)。

1.2.9黃連多糖對DPPH自由基清除作用的測定 吸取不同質(zhì)量濃度的黃連多糖樣品液1m L，加入0.004%DPPH甲醇溶液3 mL，反應(yīng)完全后避光靜置20min，517 nm波長處測定吸光度值 （A），陰性對照用蒸餾水替代樣品溶液，計(jì)算清除率，公式同 “1.2.7”項(xiàng)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1不同提取及樣品處理方法 （表2） 由表可知，回流提取法的多糖得率高于超聲及冷浸，故本實(shí)驗(yàn)采用回流提取法；粉碎過40目篩后的多糖得率高于粉碎過100目篩和未粉碎，故本實(shí)驗(yàn)選取過40目篩粉碎黃連后再進(jìn)行提取。

表2　不同提取及樣品處理方法的比較

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果 （表3） 由表可知，最佳提取條件為A2B3C2D3，即料液比1∶10，提取溫度100℃，提取時(shí)間45min，提取次數(shù)3次。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按最佳提取條件平行驗(yàn)證3次，測得黃連多糖的平均得率為1.52% （3次得率分別為1.55%、1.50%和1.52%），高于正交試驗(yàn)各組，表明該工藝重復(fù)性較好。

2.4黃連多糖對超氧陰離子自由基清除作用的測定 （圖1） 由圖可知，隨著黃連多糖質(zhì)量濃度的不斷增加，對超氧陰離子自由基的清除率逐步上升，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。

2.5黃連多糖對羥自由基清除作用的測定 （圖2） 由圖可知，黃連多糖對羥自由基的清除效果也具有劑量依賴關(guān)系，但弱于相同質(zhì)量濃度的維生素C。

2.6黃連多糖對DPPH自由基清除作用的測定（圖3）由圖可知，隨著黃連多糖質(zhì)量濃度的不斷增加，對DPPH自由基的清除率逐步上升，其清除作用接近同質(zhì)量濃度的維生素E。

圖1　黃連多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

圖2　黃連多糖對羥自由基的清除作用

圖3　黃連多糖對DPPH自由基的清除作用

3　討論

多糖為天然大分子物質(zhì)，是單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物，由于組成多糖的元素主要為碳和氧，所以多糖又稱為 “碳水化合物”，其抗氧化作用被廣泛報(bào)道［9-11］。本實(shí)驗(yàn)通過評價(jià)黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除作用，初步探討黃連多糖其體外抗氧化作用。超氧陰離子自由基可以作為多種活性氧的前體，雖然其本身氧化性較弱，但它在一定條件下會分解成氧化性很強(qiáng)的單線態(tài)氧自由基或羥自由基，均能使DNA單股鏈斷裂，最終造成機(jī)體的氧化損傷［12-13］。羥自由基作為體內(nèi)最活躍的活性氧，可引發(fā)多種疾病，故對其的檢測也是體外抗氧化活性的重要指標(biāo)之一［14］。DPPH自由基在517 nm波長處有強(qiáng)吸收峰，它是以氮原子為中心的較穩(wěn)定的自由基，抗氧化劑可以和其孤對電子配對結(jié)合，使其在517 nm波長處的吸收減弱，通過判定其程度的可以評價(jià)抗氧化活性［15］。本實(shí)驗(yàn)顯示，黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定清除作用，表明該成分具有體外抗氧化作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了黃連多糖的最佳提取工藝，同時(shí)證實(shí)了其具有體外抗氧化作用，可為將來更好開發(fā)和利用該成分奠定相關(guān)的工作基礎(chǔ)。

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R284.2

B

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2015-10-16

吉林省衛(wèi)生廳青年科研課題 （2013Q13）；吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目 （2014-ZC14）

姜 爽 （1982—），男，博士，講師，從事天然活性產(chǎn)物提取及抗糖尿病作用研究。Te1：18604498616，E-mai1：jiangshuang _2000@163.com

包 楊，女，碩士，副主治醫(yī)師，從事糖尿病的診斷與治療工作。Te1：13943188320，E-mai1：17800509@qq.com