Box-Behnken響應面法優化組織破碎提取龍膽苦苷

程振玉， 楊英杰， 成樂琴， 于麗穎， 沈啟慧， 張 儉（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022）

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Box-Behnken響應面法優化組織破碎提取龍膽苦苷

程振玉， 楊英杰*， 成樂琴， 于麗穎， 沈啟慧， 張 儉
（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022）

目的 采用Box-Behnken響應面法優化組織破碎提取龍膽苦苷。方法 以龍膽苦苷提取率為指標，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken響應面法對提取工藝進行優化。結果 最佳條件為藥材粒徑80目，料液比1∶30，電壓150 V，乙醇體積分數70%，提取時間35 s，龍膽苦苷提取率達到5.37%。結論 該方法快速高效，可顯著縮短提取時間，增加龍膽苦苷的提取率。

龍膽苦苷；組織破碎；提取工藝；Box-Behnken響應面法

龍膽草Gentiana scabra Bge.又名龍膽或地膽草，為龍膽科龍膽屬植物龍膽的根或莖部［1］，主要分布在吉林、遼寧、黑龍江和內蒙古等東北地區。藥理研究表明，其生物藥效物質基礎主要為龍膽苦苷，該成分在抑制惡性腫瘤形成、消除炎癥、促進健胃消食、抗病原微生物、抗氧化和鎮痛等方面發揮了重要作用，顯示出明顯的藥理活性［2-4］。因此，研究龍膽苦苷的提取方法，使其提取率最大程度增加，對相關新藥研發具有重要的現實意義。

龍膽苦苷的傳統提取技術大多采用回流法或連續回流法［5-6］，耗時長，溫度高，而且提取率低，嚴重影響了這一藥用資源的充分利用。近幾年隨著提取技術的不斷發展與完善，組織破碎法［7-8］等新方法已逐步應用到天然產物化學研究領域，在中藥藥理成分提取和樣品前處理中發揮了顯著作用，可大幅縮短提取時間，減少溶劑用量，而且目標產物提取率明顯增加［9］，但迄今鮮有運用該方法對龍膽草中龍膽苦苷進行提取的研究報道。響應面法是一種對工藝參數進行優化的有力手段和技術，在改善精度、提高預測性、簡便準確處理大量數據方面，具有正交試驗等一般方法無法比擬的優點，在中草藥、食品、化學化工等領域的應用越來越廣泛［10-11］。本實驗在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法進行設計，并對組織破碎法提取龍膽苦苷的工藝進行優化，為工業化進一步生產該成分提供新的數據支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 龍膽苦苷對照品 （批號MUST-14052205，四川成都曼斯特生物科技有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；乙醇為分析純；水為去離子水。龍膽草購自吉林省通化市 （產地長白山），由本校環境與生物工程學院隋新副教授鑒定為正品。

1.2儀器與設備 P230型高效液相色譜儀，配有UV-230紫外檢測器 （大連依利特分析儀器有限公司）；FA1004型電子天平 （上海舜宇恒科儀器有限公司）；SY-800超聲波清洗器 （上海寧商超生儀器有限公司）；JHBE-50S型閃式提取器（河南金鼎科技發展有限公司）；RT-08型多功能粉粹機 （榮聰精密科技有限公司）；RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D型循環水式真空泵 （河南省鞏義市英峪儀器一廠）。

1.3方法

1.3.1HPLC條件 Hypersi1ODS C18色譜柱（4.6 mm× 250mm，5μm）；進樣量20μL；體積流量1.0 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫25℃；流動相乙腈 （A）-0.4%磷酸 （B），梯度洗脫 （0～10 min，5% ～28%A；10～16 min，28%～30%A；16～16.1 min，30%～100%A，保持14min；30～30.1min，100%～5%A，保持15min）。

1.3.2標準曲線的繪制 取置于干燥器中48 h以上的龍膽苦苷標準品，精密稱取11.40 mg，甲醇溶解，搖勻，定容到25 mL量瓶中，得到456.0μg/mL標準品貯備液。吸取適量，連續稀釋，得到456.0、342.0、228.0、114.0、57.0、28.5、9.12μg/m L溶液，在 “1.3.1”項條件下進行分析。

1.3.3單因素試驗 將干燥龍膽苦苷粉碎，過不同孔徑篩子。精密稱取5.0 g，平行3份，按照一定料液比加入不同體積分數的乙醇，置于閃式提取器中，在一定的電壓下提取一段時間。提取結束后，將所得混合液進行抽濾，除去龍膽藥渣，濾液置于500 m L量瓶中，適量提取溶劑清洗提取器刀頭和藥渣，洗滌液繼續抽濾，濾液轉移到量瓶中，適量提取劑定容，搖勻，得到一定質量濃度的龍膽苦苷提取液。吸取少量，過0.45μm尼龍微孔濾膜，進樣，HPLC法分析含有量，考察料液比、提取電壓、乙醇體積分數、藥材粒徑、提取時間等因素對龍膽苦苷提取率的影響。

1.3.4組織破碎法提取龍膽苦苷的響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法，對提取工藝作進一步優化。因素水平見表1。

表1　因素水平

2　結果與分析

2.1HPLC色譜圖與標準曲線 在“1.3.1”項條件下，基線無漂移現象，峰形不擴張、不拖尾，目標組分龍膽苦苷與共存雜質得到了良好的分離，而且出峰相對較早，分析時間適宜，見圖1。以龍膽苦苷峰面積 （Y）對其質量濃度（μg/mL，X）回歸，得到標準曲線方程 Y= 15.451 X+117.62，R2=0.999 9，表明龍膽苦苷在9.12～456.0mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

圖1　HPLC色譜圖

2.2單因素試驗結果

2.2.1電壓對龍膽苦苷提取率的影響 固定藥材粒徑100目、料液比1∶20、乙醇體積分數100%、提取時間30 s，電壓對龍膽苦苷提取率的影響見圖2。由圖可知，電壓從90 V變化到150 V時，提取率急劇增加；超過150 V后，提取率增加趨勢變緩，可能是因為電壓越高，閃式提取器內刃轉速越高，顯著增加內刃與外刃間的切割作用，促進藥材的破碎，同時切割作用會使內刃中心產生強力渦流，促進整個體系處于劇烈攪拌之中，從而加速目標成分在從細胞組織擴散到提取劑中的速率［12］。但電壓過高會嚴重影響電機，故從降低能耗和保護設備的角度綜合考慮，選擇150 V作為最佳電壓。

圖2　電壓對龍膽苦苷提取率的影響

2.2.2藥材粒徑對龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、料液比1∶20、乙醇體積分數100%、提取時間30 s，藥材粒徑對龍膽苦苷提取率的影響見圖3。由圖可知，在粒徑小于80目時，提取率隨藥材粒徑的減小而急劇增加，但粒徑進一步減小后無明顯變化，這可能是由于閃式提取器的破碎刀頭在設計時把破碎粒徑控制在一定范圍。目數越大，粒徑越小，與適當溶劑混合后，在劇烈攪拌和和振動作用下，藥材中的目標成分能快速轉移到提取劑中，但粒徑過小時會增加后續的過濾的難度。因此，選擇80作為最佳粒徑。

圖3　藥材粒徑對龍膽苦苷提取率的影響

2.2.3乙醇體積分數對龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、料液比1∶20、藥材粒徑80目、提取時間30 s，乙醇體積分數對龍膽苦苷提取率的影響見圖4。由圖可知，當乙醇體積分數低于80%時，提取率隨著其增大而逐漸上升；進一步增加乙醇體積分數，提取率反而降低，這可能是由于乙醇滲透能力強于水，故乙醇體積分數提高能加速目標成分在提取劑和細胞基質之間的溶解平衡；乙醇體積分數越高，提取劑極性越小，而龍膽苦苷是極性分子，根據相似相溶原理，其溶解度將會減小，從而降低提取率。因此，選擇80%～100%作為乙醇最佳體積分數。

圖4　乙醇體積分數對龍膽苦苷提取率的影響

2.2.4提取時間對龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、料液比1∶20、藥材粒徑為80目、乙醇體積分數80%，提取時間對龍膽苦苷提取率的影響見圖5。由圖可知，在40 s前，提取率逐漸增加；40 s后，提取率反而急劇減小，這可能是由于經過長時間提取后，提取器破碎刀頭內外刀刃間產生許多熱量，溶液溫度逐漸升高，超過一定溫度后龍膽苦苷被氧化，導致結構改變。因此，選擇20～40 s作為最佳提取時間。

圖5　提取時間對龍膽苦苷提取率的影響

2.2.5料液比對龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、提取時間40 s、藥材粒徑80目、乙醇體積分數80%，料液比對龍膽苦苷提取率的影響見圖6。由圖可知，當料液比由1∶10增加到1∶30時，提取率逐漸增加；進一步增加溶劑用量，提取率反而急劇降低，這可能是因為隨著提取劑用量不斷增加，小粒徑藥材與提取器破碎刀頭相互接觸的概率越來越小，從而引起刀頭剪切幾率下降，最終導致龍膽苦苷提取不完全。因此，選擇1∶20～1∶40作為最佳料液比。

2.3Box-Behnken響應面分析

2.3.1模型建立及顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.0軟件設計響應面試驗，結果見表2。

圖6　料液比對龍膽苦苷提取率的影響

表2　試驗設計與結果

對表2數據進行擬合，得到回歸方程：Y=5.48+5× 10-3A-0.055B-0.020C+0.070AB-0.015AC-0.060BC-0.29A2-0.11B2-0.30C2。方差分析見表3。

表3　方差分析

由表3可知，該模型的F值為6.15，P值為0.012 8（小于0.05），表明該模型顯著。A2和C2項均表現出了非常顯著的作用 （P＜0.05），但其他因素影響不明顯 （P＞0.05），故料液比、提取時間與乙醇體積分數對提取率的影響未呈現一般線性相關性，相互影響作用非常小，可不予考慮［13］。失擬項F值為3.24，P值大于0.05，表明不存在異常點，模型無誤，不必引入更高次數的項進行研究。R2=88.78%，表明試驗中88.78%的數據可以用該模型來解釋［14］。綜上所述，該模型可靠性與準確性較高。

2.3.2提取工藝的響應曲面分析與優化 為了更簡明地表現2個考察因素同時對目標成分提取率的影響，可令其它因素水平值為零［15］，將3個因素中的1個取零水平，分析另2個因素對響應值的影響。結果見圖7。

圖7　響應面圖

由圖可知，料液比、乙醇體積分數和提取時間對龍膽苦苷的提取率都有影響。但是，圖中曲線坡度均較小，變化緩慢，說明三者對龍膽苦苷提取率的影響不顯著。

采用Design-Expert軟件對參數作進一步優化，得到最優條件為料液比1∶29.77，提取時間34.73 s，乙醇體積分數69.93%。在此條件下，龍膽苦苷提取率達到5.49%。考慮操作可行性和簡便性，最終確定為料液比1∶30，加入70%乙醇150 mL，在150 V電壓下提取35 s。

2.4最佳試驗條件的結果驗證 精密稱取樣品5.0 g，在最佳工藝下進行提取，平行3次。結果，龍膽苦苷提取率達到5.37%，與響應面預測值 （5.49%）相當，表明該模型合理，試驗結果理想。

2.5不同方法提取龍膽苦苷的比較 為了進一步對該工藝進行驗證，本實驗將其與傳統回流法［16］進行比較，文獻報道的最佳工藝為稱取樣品5.0 g，加入50 mL 70%乙醇，71.5℃下提取3 h，龍膽苦苷提取率為4.96%。由此可知，本實驗建立的方法耗時更短，能耗更低，而且提取率明顯增加。

3　結論

組織破碎法作為一種新型提取工藝，因具有操作簡便、時間短、能耗低、提取率高等特點而廣泛應用于中草藥活性成分提取，本實驗采用該技術實現了龍膽草中有效成分龍膽苦苷的高效提取，確定最佳工藝條件為按照1∶30料液比加入70%乙醇，在150 V電壓下提取35 s，龍膽苦苷提取率達到5.37%。與傳統回流法相比，不僅提取時間明顯減少，而且提取率顯著提高，故該技術為工業生產中龍膽苦苷的提取提供了新的數據支撐和理論依據。

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R284.2

B

1001-1528（2016）06-1408-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.045

2015-04-10

吉林省教育廳科技計劃項目 （吉教科合字 ［2006］88號）

程振玉 （1986—），男，碩士生，助教，從事天然產物化學和有機分析研究。Te1：15843289508，E-mai1：chengzhenyu0633@ 126.com

楊英杰 （1955—），男，教授，從事精細有機化學合成與應用研究。Te1：13843228673，E-mai1：yanghjm@163.com