超聲提取麻花秦艽花中龍膽苦苷的最佳工藝

馬 琳， 張耀洲*， 唐楚沉（.天津大學藥物科學與技術學院，天津30007；.浙江理工大學生命科學學院，浙江杭州3008）

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超聲提取麻花秦艽花中龍膽苦苷的最佳工藝

馬 琳1， 張耀洲1*， 唐楚沉2
（1.天津大學藥物科學與技術學院，天津300072；2.浙江理工大學生命科學學院，浙江杭州310018）

目的 研究麻花秦艽花中龍膽苦苷的最佳超聲提取工藝。方法 采用UPLC結合響應面法對麻花秦艽花中龍膽苦苷超聲提取工藝進行優化。結果 最佳條件為提取時間80min，料液比1∶24，甲醇體積分數93%，提取3次。供試液中龍膽苦苷峰面積的實測值為2 164.60，與預測值 （2 120.64）相差僅2.05%。結論 該模型預測性良好，而且優化條件可靠。

麻花秦艽花；龍膽苦苷；超聲提??；UPLC；響應曲面法

麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.為多年生草本，屬龍膽科龍膽屬秦艽組，主要分布于陜西、甘肅、四川、青海和內蒙古等地，大多生長于高山草甸、山地草場、亞高山或高山灌叢和林園陽坡等地［1］。該植物以花入藥，性味苦、平，有祛風濕、清濕熱、止麻痹等功效，臨床上用于治療風濕痹痛、筋脈痙攣、日曝潮熱和小兒瘡積發熱等癥［2-3］。藥理研究表明，秦艽中含有以龍膽苦苷為代表的環烯醚萜苷類活性成分，對風濕性關節炎有顯著療效，可治療消化不良，對多種肝損傷起到保護作用，還具有利膽、利尿、抗菌、抗炎、抗過敏、抗病原蟲、退熱鎮痛、抗腫瘤及減輕CC14毒性等活性［4-6］。為合理開發利用這一藥材資源，最大限度地提取其有效成分，本實驗在預實驗基礎上，以提取時間、料液比和甲醇體積分數3個因素為影響因子，應用Box-Behnken中心組合設計建立數學模型，以供試液中龍膽苦苷的峰面積為響應值，得到龍膽苦苷超聲提取的最佳工藝。

1　儀器、試劑與材料

1.1儀器 Acquity UPLC色譜儀，包括Acquity UPLC PDA檢測器、Empower 2色譜工作站（美國Waters公司）；AL204型電子天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；RE-52型旋轉蒸發儀 （上海亞榮生化儀器廠）；JP300型超聲提取器 （武漢嘉鵬電子有限公司）。

1.2試劑 龍膽苦苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號1107702200308，純度＞98%，20mg/支）；UPLC用甲醇 （色譜純）、提取用甲醇 （分析純）（天津康科德試劑有限公司）。

1.3材料 麻花秦艽花于2013年購自陜西省漢中藥材市場，經中國科學院西北高原生物研究所王啟蘭副研究員鑒定為龍膽屬植物麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.的花。60℃下干燥，粉碎，過40目篩，密封備用。

2　方法與結果

2.1色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm× 2.1mm，1.7μm）；柱溫40℃；樣品室溫度8℃；流動相為甲醇∶水 （30∶70）；檢測波長270 nm；進樣量3μL。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品55mg，置于100 mL燒杯中，適量色譜純甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，色譜純甲醇定容，搖勻，即得5.5 mg/mL對照品溶液，備用。

2.3標準曲線的制備 精密吸取 “2.2”項下對照品溶液1、3、5、7、9μL，在 “2.1”項色譜條件下依次進樣，以進樣量為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標 （Y），得到回歸方程Y=1 266.84X+1.04（r2=1），表明龍膽苦苷在5.5～49.5μg范圍內呈良好的線性關系。

2.4樣品的提取 根據預實驗結果，確定提取次數為3次。根據中心組合試驗設計原理，選擇提取時間 （X1）、料液比 （X2）和甲醇體積分數 （X3）作為考察因素，每個因素3個水平。見表1。

表1　因素水平

取密封保存的麻花秦艽花粉末1.00 g，超聲提取，過濾，濾液在旋轉蒸發儀上減壓干燥，干浸膏用甲醇超聲溶解，轉移到25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22μm微孔濾膜過濾，作為供試樣品溶液。對照品及樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1　龍膽苦苷對照品

圖2　麻花秦艽花樣品

2.5響應面試驗 采用Box-Behnken試驗設計方案，以供試液樣品溶液中龍膽苦苷的峰面積值 （Y）為響應值，共設計17組試驗，Design Expert 7.0.0軟件對龍膽苦苷提取工藝進行優化［7-9］。結果見表2。

2.6響應面試驗結果分析

2.6.1供試液中龍膽苦苷的峰面積回歸模型的建立及顯著性檢驗 Design Expert7.0.0軟件對試驗數據進行多元回歸和二項式擬合，得到回歸方程

表2　Box-Behnken試驗設計與結果

對該回歸模型進行方差分析，結果見表3，發現線性關系顯著 （r=0.978 6）；模型顯著水平P＜0.000 1，說明該模型非常顯著；模型失擬項P=0.38＞0.000 5不顯著，表明該方程擬合度良好，誤差小。因此，可用該回歸方程代替試驗真實點來進行分析和預測。X2的F值小于0.000 1，表明其對龍膽苦苷提取的影響非常顯著；X3的F值小于0.001，表明影響很顯著；X1的F值小于0.01，表明影響較顯著。各二次項因素按影響大小排序，依次為；交互項按影響大小排序，依次為 X2X3、 X1X3、X1X2，表明各因素對龍膽苦苷提取的影響不是簡單的線性關系，響應曲面圖見圖4～6。

表3　方差分析

2.6.2響應面及等高線分析 圖3A～5A是提取時間、甲醇體積分數和料液比的響應面圖，可反映出任意兩因素及其交互作用對麻花秦艽花中龍膽苦苷提取的影響?；貧w方程在所選范圍的極大值可以用響應面曲線圖的最高點標示，而兩個變量之間的交互作用是否顯著可以從等高線 （圖3B～5B）的形狀來判斷。等高線圖越趨近于圓形，表示交互作用越不顯著；越趨于橢圓形，表示交互作用越強［10］。

圖3　提取時間和甲醇體積分數對龍膽苦苷的影響

圖4　料液比和提取時間對龍膽苦苷的影響

為了確定龍膽苦苷最佳的提取工藝，利用Design Expert7.0.0軟件對響應面試驗結果作進一步優化，以龍膽苦苷峰面積為指標，得到最佳條件為提取時間80 min，料液比1∶24，甲醇體積分數93%。此條件下，龍膽苦苷峰面積為2 120.64。

圖5　甲醇體積分數和料液比對龍膽苦苷的影響

2.7最佳工藝條件驗證 平行試驗3次，結果見表4。由表可知，該模型預測性良好 （與預測值2 120.64相差僅2.05%），優化工藝條件可靠。

表4　驗證實驗結果

3　討論

本實驗采用UPLC法對麻花秦艽花藥材中龍膽苦苷的含有量進行測定，與常用的HPLC法相比，在保持較高準確度和精密度的同時，還提高了分析效率。同樣流動相下，龍膽苦苷的保留時間從9.8min銳減到2.5 min，分析時間大幅度縮短，從而減少了溶劑損耗及廢液處理成本，可為麻花秦艽花的質量控制及相關產品的開發利用提供一種更快捷、精準的測定方法。

同時，采用Box-Behnken響應面法對提取工藝進行了優化，所得最佳條件 （提取時間80 min，料液比1∶24，甲醇體積分數93%，提取3次）與實際結果的吻合性較好，說明該方法在操作上可靠，而且重復性良好。

［1］中國科學院 《中國植物志》編輯委員會.中國植物志：第79卷［M］.北京：科學出版社，2009.

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R284.2

B

1001-1528（2016）06-1412-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.046

2015-04-20

馬 琳 （1990—），女，碩士生，研究方向為天然產物分離與提取。E-mai1：yuyu88196@163.com

張耀洲 （1964—），男，教授，研究方向為生物化學與分子生物學、天然產物分離與提取。E-mai1：zyz_tjedu@126.com