松果菊苷通過調控GFRα1/AKT信號通路抑制MPP+誘導的多巴胺能細胞SH-SY5Y凋亡

趙 卿， 張 鵬， 白 宇， 張利軍， 侯郁青， 蔡定芳（.上海中醫藥大學附屬普陀醫院神經內科，上海0006；.上海中醫藥大學附屬普陀醫院中心實驗室，上海0006；3.復旦大學附屬中山醫院中西醫結合科，上海0003；4.復旦大學中西醫結合研究所，上海0003）

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松果菊苷通過調控GFRα1/AKT信號通路抑制MPP+誘導的多巴胺能細胞SH-SY5Y凋亡

趙 卿1， 張 鵬2， 白 宇1， 張利軍1， 侯郁青1， 蔡定芳3，4
（1.上海中醫藥大學附屬普陀醫院神經內科，上海200062；2.上海中醫藥大學附屬普陀醫院中心實驗室，上海200062；3.復旦大學附屬中山醫院中西醫結合科，上海200032；4.復旦大學中西醫結合研究所，上海200032）

目的 研究肉蓯蓉提取物松果菊苷（echinacoside）對1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導帕金森病模型SH-SY5Y細胞的保護機制。方法 SH-SY5Y細胞分別接受磷酸緩沖溶液 （PBS）、MPP+和/或松果菊苷處理后，分析細胞生長情況，采用Western b1ot結合免疫熒光法分析各處理組細胞內膠質細胞源性神經營養因子家族受體α1（GFRα1）及其下游抗凋亡AKT（蛋白激酶B）磷酸化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）水平變化，并觀察AKT抑制劑LY249002對松果菊苷對SH-SY5Y的保護功能的影響。結果 松果菊苷可以顯著緩解MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡［MPP+vs MPP+/松果菊苷，（25.12±4.33）%vs（5.13±1.51）%，P＜0.01］。松果菊苷可以抑制MPP+下調SHSY5Y細胞內GFRα1表達和AKT磷酸化。進一步的研究表明特異性阻斷AKT信號通路可以取消松果菊苷促進SHSY5Y在MPP+誘導損傷下生存的功能，但不影響松果菊苷提高GFRα1的表達。對SH-SY5Y細胞內Caspase-3活性分析的結果顯示，松果菊苷可以抑制MPP+誘導Caspase-3的活化［MPP+vs MPP+/松果菊苷，（7.22±1.51）vs（1.81±0.42），P＜0.01］，但是這一作用可以被AKT抑制劑阻斷。結論 松果菊苷通過上調GFRα1/AKT通路抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，發揮保護神經細胞存活的功能。

松果菊苷；SH-SY5Y細胞；1-甲基-4-苯基吡啶 （MPP+）；膠質細胞源性神經營養因子受體α1（GFRα1）；GFRα1/AKT信號通路；凋亡

隨著我國老年人口的不斷增加，神經退行性疾病的發病率也逐年提高。帕金森病（Parkinson's disease，PD）發病率在神經退行性疾病中占第二位［1］。PD患者中腦黑質區多巴胺能神經元丟失導致運動神經元重要神經遞質多巴胺合成和釋放都急劇下降［2］使病人出現少動、震顫、強直等運動障礙癥狀。如何抑制多巴胺能神經元的減少和增加腦內多巴胺含有量是治療PD的主要方案，而與多巴胺替代治療相比，保護多巴胺能神經元和減少多巴胺能神經元的凋亡是更加根本性的治療［3］。但到目前為止，臨床上還沒有發現特異性保護大腦多巴胺能神經元的治療藥物。松果菊苷（echinacoside，ECH）是傳統中藥肉蓯蓉中提取的主要活性糖苷，已有研究表明松果菊苷具有較強的抗自由基能力［4］。體外實驗已經證明松果菊苷可抑制大鼠神經元樣細胞PC12［5］、小腸內皮細胞［6］和人神經元樣細胞SH-SY5Y細胞 （又稱神經母細胞瘤細胞）［7］的凋亡；本課題組前期體內研究表明，松果菊苷可以緩解1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methy1-4-pheny1-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導的小鼠的PD癥狀，抑制PD小鼠紋狀體內多巴胺能神經元的凋亡，并促進膠質細胞源性神經營養因子（g1ia1ce11-derived neurotrophic factor，GDNF）的表達［8-9］。SH-SY5Y細胞具有合成多巴胺和多巴胺受體的特征，1-甲基-4苯基吡啶離子（1-methy1-4-pheny1pyridiniumion，MPP+）誘導的SH-SY5Y細胞凋亡模型已經被廣泛應用于研究PD發病的分子機制和藥效學評價［7，10-11］。另有研究發現，松果菊苷可以通過保護線粒體發揮抑制MPP+誘導SH-SY5Y細胞的凋亡［12］。為了進一步揭示松果菊苷保護神經細胞的分子機制，本研究以MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡為PD細胞模型，研究神經細胞增殖和促存活調控關鍵受體—GDNF受體α1（GDNF receptorα1，GFRα1）和其下游信號通路中重要激酶AKT是否參與松果菊苷保護神經細胞的調控。

1　材料與方法

1.1藥物和試劑 松果菊苷（純度大于98%）購買自成都普思生物科技有限公司 （PS0004-0100，20 mg）；雙苯酰亞胺（Hoechst 33342）、多聚L-賴氨酸和碘化1-甲基-4苯基吡啶 （水溶液中解離成MPP+）從美國Sigma公司購買；DMEM細胞培養基和胎牛血清從美國Gibco公司購買；AKT磷酸化抑制劑LY294002從美國Santa Cruz公司購買；化學發光底物從蘇州康為世紀公司購買；Caspase-3活性檢測試劑盒從碧云天生物技術研究所購買。

1.2細胞培養和處理 SH-SY5Y細胞購買自上海中國科學院細胞庫。細胞被培養在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基。培養溫度為37℃，培養箱內含飽和水氣和5%CO2。MPP+在使用前用滅菌水配制，松果菊苷被溶于滅菌的磷酸緩沖溶液 （PBS）溶液里。加藥處理前，細胞被種到6孔細胞培養板中，每孔5×105，培養24 h后，加藥后繼續培養24 h收樣。細胞用RIPA裂解液（購買自上海多彩生物科技有限公司）裂解后用Western b1ot分析AKT磷酸化水平和GFRα1水平。

1.3細胞活力分析 細胞被種到24孔培養板中，每孔8×104，24 h后分別給與1 mmo1/L MPP+、40μg/mL的松果菊苷或40μg/mL松果菊苷+ 1 mmo1/L MPP+、PBS作為對照。在研究松果菊苷調控AKT磷酸化與SH-SY5Y細胞凋亡關系時，細胞藥物處理中全部加入1 mmo1/L的MPP+，實驗組細胞分別加入40μg/mL松果菊苷、40μg/mL松果菊苷+20μmo1/L LY490002，空白對照僅加PBS對照，無任何藥物處理。所有細胞活力分析，每個處理設6個復孔，實驗重復3次。實驗開始每天計數活細胞數。

1.4Western b1ot分析 Western b1ot用常規方法，具體見參考文獻 ［13］。兔抗AKT抗體、兔抗磷酸化AKT S473抗體和兔抗GFRα1抗體從美國CST公司購買，按照1∶1 000稀釋倍數用于雜交轉印后的PVDF膜（購自美國Pa11公司）。小鼠抗β-Actin單克隆抗體（購自美國Santa Cruz）按照1∶3 000稀釋倍數雜交轉印后的PVDF膜。HRP偶聯的羊抗兔IgG和HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG（購自美國Jackson Immuno Research Laboratories）按照1∶10 000稀釋倍數用于Western b1ot。顯色采用化學發光的方法，用天能化學發光成像儀 （上海天能）采集和分析圖像。

1.5免疫熒光分析 細胞種到用多聚賴氨酸包被過的蓋玻片上，培養過夜，加入不同的藥物處理24 h后，用冷甲醇固定。小鼠抗α-Tubu1in單克隆抗體（購自美國Sigma公司）和兔抗GFRα1抗體（購自美國CST公司）都按照1∶1 000稀釋到一抗稀釋液 （購自上海多彩生物科技有限公司）中使用。具體方法按照抗體說明書操作。二抗分別使用FITC標記的羊抗小鼠IgG和A1ex565標記的羊抗兔IgG（購買自美國Life Techno1ogies公司），1∶2 000稀釋后使用，使用方法參照二抗說明書進行。細胞核用5μg/m L的Hoechst 33342室溫染色5 min，PBS洗滌4次后，用甘油封片。細胞爬片用萊卡SP8激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司制造）觀察和拍照。

1.6TUNEL標記細胞凋亡分析 細胞爬片制備和藥物處理和免疫熒光相同。實驗分為對照組、40μg/m L松果菊苷、1 mmo1/L MPP+、MPP+/松果菊苷組。細胞處理24 h后，用冷PBS洗滌2次后，冷甲醇固定。根據Tune1試劑盒 （羅氏診斷公司）說明書進行標記。結果用尼康熒光顯微鏡（NIKON，日本）拍照，每個爬片選取不連續的5個視野，統計陽性細胞率。

1.7Caspase-3活性分析 細胞被種到6孔培養板中，每孔5×105，24 h后分別給與1 mmo1/L MPP+、40μg/mL的松果菊苷或40μg/m L松果菊苷+1 mmo1/LMPP+，PBS作為對照。在研究松果菊苷調控AKT磷酸化與SH-SY5Y細胞凋亡關系時，細胞藥物處理中全部加入1 mmo1/L的MPP+，實驗組細胞分別加入 40μg/m L松果菊苷、40μg/m L松果菊苷+20μmo1/L LY490002，空白對照僅加PBS對照，無任何藥物處理。細胞加藥后24 h，用Caspase-3試劑盒的細胞裂解液裂解細胞，并定量蛋白后，按照說明書方法進行測定。每個處理設3個復孔，實驗重復3次。

1.8結果統計 所有Western b1ot結果用天能圖像分析系統進行灰度分析，并以內參蛋白作為對照，結果為目的蛋白與內參蛋白灰度的比值。磷酸化水平表示為以磷酸化信號與總蛋白信號的比值。數據處理用微軟EXCEL完成，并使用學生氏t檢驗進行顯著性檢驗，當P＜0.05時為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結果

2.1松果菊苷減少MPP+誘導SH-SY5Y的凋亡

已有多個研究表明MPP+可以誘導SH-SY5Y細胞凋亡，本研究中通過SH-SY5Y生長曲線顯示，MPP+也顯著抑制了SH-SY5Y細胞的生長，處理3 d時抑制率為80.4% （圖1A～B），并明顯誘導細胞凋亡（圖1C～D）。單獨加入松果菊苷對SHSY5Y細胞的正常生長沒有明顯的影響，但是對于存在MPP+時，松果菊苷可以顯著的減少SH-SY5Y細胞的凋亡，保護了SH-SY5Y細胞和恢復了在MPP+存在時細胞的生長 （圖1A）。細胞的形態顯示松果菊苷保護了細胞正常結構，減少細胞凋亡（圖1B）。采用TUNEL標記法分析凋亡細胞水平顯示，MPP+顯著地誘導了SH-SY5Y細胞的凋亡［MPP+處理組vs對照組，（25.12±4.33）%vs（3.01±0.51）%，P＜0.01］。而且松果菊苷可以顯著的降低凋亡細胞比例（MPP+vs MPP+/松果菊苷，（25.12±4.33）%vs（5.13±1.51）%，P＜0.01）。這些結果表明松果菊苷可以的保護SH-SY5Y細胞，抑制MPP+誘導的細胞凋亡（圖1C～D）。

2.2松果菊苷抑制MPP+誘導的GFRα1水平下降和AKT磷酸化水平的降低 AKT作為GDNF/ GFRα1信號通路下游的重要蛋白磷酸化激酶，在細胞生長和抗凋亡方面發揮重要的調控功能。因此，本研究調查MPP+是否也調控了SH-SY5Y細胞內的GFRα1水平，結果顯示，MPP+下調了GFRα1水平，同時，MPP+也可以抑制SH-SY5Y細胞內的AKT磷酸化水平 （圖2）。松果菊苷處理可以有效地抑制MPP+的這一功能，部分恢復由于MPP+導致的SH-SY5Y細胞中GFRα1水平下降和AKT磷酸水平降低 （圖2）。這個結果和GFRα1的免疫熒光檢測結果相一致。松果菊苷可以部分恢復SH-SY5Y細胞在MPP+存在的條件下GFRα1的表達 （圖3）。

圖1　松果菊苷保護SH-SY5Y細胞和抑制MPP+誘導的細胞凋亡Fig.1 ECH protects cells against cell apop tosis induced by MPP+

圖2　W estern blot分析松果菊苷對MPP+誘導SH-SY5Y細胞內GFRα1水平和AKT磷酸化水平變化的影響Fig.2 Effects of ECH on changes of GFRα1 and phosphorylated AKT regulated by M PP+in SH-SY5Y cells

圖3　共聚焦分析松果菊苷逆轉MPP+誘導SH-SY5Y細胞中GFRα1水平下降 （×630）Fig.3 ECH recovers GFRα1 expression in SH-SY5Y cells during MPP+treatment（×630）

2.3AKT磷酸化水平影響松果菊苷保護SH-SY5Y效果 考慮到AKT在GDNF/GFRα1信號通路中的重要地位，本研究進一步調查了AKT磷酸化在松果菊苷發揮抗神經元樣細胞凋亡功能中的作用。結果顯示，給予AKT磷酸化抑制劑LY294002可以有效的阻斷松果菊苷的SH-SY5Y細胞保護功能（圖4A）。Western b1ot結果顯示，LY294002有效的抑制AKT的磷酸化，對GFRα1表達沒有明顯的影響（圖4B～C）。

2.4松果菊苷抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞內Caspase-3活化 為了進一步研究松果菊苷抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，本研究檢測了松果菊苷對MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡過程中的重要細胞凋亡調控Caspase-3的活性。結果顯示，松果菊苷顯著地抑制了MPP+誘導的SH-SY5Y細胞內Caspase-3的活性增加（MPP+vs MPP+/松果菊苷是7.22±1.51 vs 1.81±0.42，P＜0.01）。此外，抑制AKT的磷酸化可以取消松果菊苷的上述作用。這些結果和松果菊苷保護SH-SY5Y結果相一致。見圖5。

圖4　AKT抑制劑阻斷松果菊苷保護SH-SY5Y功能Fig.4 AKT inhibitor blocks ECH function of protecting SH-SY5Y cells apoptosis induced by M PP+

3　討論

PD作為世界上第二大神經退行性疾病，其發病和衰老具有重要的相關性。組織和分子病理研究顯示，GDNF水平的下降和多巴胺能神經元內PI3K/AKT信號通路的抑制在PD的發展過程中發揮了重要的調控作用［14-16］。其直接的病理表現為α-突觸核蛋白（α-synuc1ein）聚集，形成路易氏小體，多巴胺能神經元的功能逐漸喪失和凋亡［1］。最新的研究表明，當GDNF/Ret通路被阻斷后，GDNF/GFRα1可以發揮與GDNF/Ret相同的對多巴胺能神經元系統的保護功能［17］。此外，更多的研究也證明了GFRα1相對于其他GDNF的受體，對于多巴胺能運動神經元的分化和增殖發揮了更重要的調控功能［18-19］。祖國醫學早在 《黃帝內經》中已經出現了震顫類疾病的記載，其發病機制多與“肝腎不足、陰虛風動”有關。臨床中使用 “補腎養肝”方藥治療帕金森病患者能明顯延緩癥狀的加重［20］，其中具有代表性的中藥肉蓯蓉素有 “沙漠人參”之美譽，具有極高的藥用價值，是中國傳統的名貴中藥材。肉蓯蓉味甘、性溫，具有補腎壯陽、填精補髓、養血潤燥等功效。松果菊苷是其主要活性成分之一。前期實驗結果表明松果菊苷能上調PD小鼠模型中腦組織GDNF表達，本研究借助細胞模型深入探討松果菊苷對GDNF相關受體和信號通路的調控。本研究中觀察到的松果菊苷可以提高SH-SY5Y細胞表達GFRα1，并對MPP+誘導的細胞損傷有保護作用，結果與上述文獻報道相一致。最近研究已經證實，PI3K/AKT信號通路作為GDNF/GFRα1通路的下游，參與GFRα1多種生物學功能的調控，尤其是促增殖與抗凋亡［21-22］。MPP+可以通過抑制AKT磷酸化來發揮誘導神經細胞凋亡的功能［23］。本研究結果顯示了在SH-SY5Y細胞里，MPP+不僅抑制AKT的磷酸化，同時還下調了GFRα1的表達（圖2）。松果菊苷可以顯著的逆轉MPP+抑制AKT磷酸化與GFRα1表達的功能。但通過使用AKT抑制劑阻斷AKT磷酸化后，松果菊苷雖然仍然可以提高GFRα1的表達，但其促進SH-SY5Y存活的功能并沒有恢復 （圖4）。這些結果表明，AKT的磷酸化是松果菊苷保護SH-SY5Y細胞、抑制MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡的關鍵調控激酶。綜合結果，本研究揭示了松果菊苷保護SH-SY5Y一個新的分子機制 （圖5B），即通過上調GFRα1表達來激活AKT來實現松果菊苷對SHSY5Y細胞的保護，AKT信號通路處于松果菊苷發揮保護功能的關鍵地位。

致謝 感謝上海交通大學生命科學技術學院袁運生博士在細胞培養和其他實驗技術方面提供的幫助。

圖5　松果菊苷通過AKT通路抑制MPP+誘導的Caspase-3活化和調控SH-SY5Y細胞凋亡Fig.5 ECH inhibits Caspase-3 activation and cell apoptosis induced by M PP+in SH-SY5Y cells

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Echinacoside inhibits apoptosis of SH-SY5Y cell through GFRα1/AKT pathway

ZHAO Qing1， ZHANG Peng2， BAIYu1， ZHANG Li-jun1， HOU Yu-qing1， CAIDing-fang3，4

（1.Department of Neurology，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；2.Central Laboratory，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；3.Department of Integrative Medicine，Zhongs-

han Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China；4.Institute of Integrative Medicine，Fudan University，Shanghai200032，China）

AIM To study the protective effects of echinacoside，extracted from Cistanches Herba，on 1-methy1-4-pheny1pyridiniumion（MPP+）-induced SH-SY5Y ce11s of Parkinson's disease mode1.M ETHODS After SH-SY5Y ce11s were treated with phosphate buffer sa1ine（PBS），40μg/mL echinacoside，1 mmo1/L MPP+，and/or both of echinacoside and MPP+，ce11pro1iferation was detected，and GFRα1，phosphory1ated AKTmo1ecu1e（protein kinase B）aswe11as Caspase-3 protein 1eve1were ana1yzed byWestern b1ot and immunof1uorescence. Echinacoside's protective effects were a1so eva1uated when AKT phosphory1ation was b1ocked by an AKT specific inhibitor，LY49002.RESULTS Echinacoside significant1y decreased ce11 apoptosis induced by MPP+in SHSY5Y ce11s［MPP+vs MPP+/echinacoside，（25.12±4.33）%vs（5.13±1.51）%，P＜0.01］.Data indicated that echinacoside cou1d up-regu1ate the expression of GFRα1，a critica1pro-surviva1 receptor，and improve AKT phosphory1ation after SH-SY5Y ce11swere exposed to MPP+.Further study suggested that LY49002 cou1d abrogate echinacoside's function of improving ce11surviva1butnotaffecting its effectof increasing GFRα1.Echinacoside a1-so cou1d inhibit Caspase-3 activation induced by MPP+in SH-SY5Y［MPP+vs MPP+/ECH，（7.22±1.51）vs（1.81±0.42），P＜0.01］.But its function depended on AKT activation.CONCLUSION In summary，our data strong1y support that echinacoside protects ce11 against MPP+-induced apoptosis through GFRα1/AKT signa1 pathway in SH-SY5Y ce11s.

echinacoside；SH-SY5Y ce11；MPP+（1-methy1-4-pheny1pyridiniumion）；g1ia1 ce11-derived neurotrophic factor fami1y receptorα1（GFRα1）；GFRα1/AKT singa1pathway；apoptosis

R966

A

1001-1528（2016）06-1225-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.005

2015-12-04

國家自然科學基金青年項目 （81202814）；上海市衛生和計劃生育委員會青年課題 （20124y116）

趙 卿 （1978—），博士，主治醫師，主要從事神經內科相關疾病的臨床和基礎研究。Te1：（021）22233222-58082，E-mai1：qingzhao2010@hotmai1.com