桑蠶蛹多糖超聲提取優化及水溶性多糖組分分析

譚麗鶴， 李紅玉（錦州醫科大學，遼寧錦州121000）

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桑蠶蛹多糖超聲提取優化及水溶性多糖組分分析

譚麗鶴， 李紅玉*
（錦州醫科大學，遼寧錦州121000）

目的 優化桑蠶蛹多糖的超聲提取工藝，并采用氣質聯用 （GC-MS）及紅外光譜 （IR）法對水溶性多糖（PSP1）進行組分分析。方法 以多糖得率為指標，采用Box-Behnken設計和響應面法優化超聲提取工藝。多糖透析后，樹脂柱層析得到水溶性多糖 （PSP1），GC-MS和IR法分析其組分。結果 最佳條件為超聲功率760 W，液料比11∶1，提取時間10 min，得率15.28%。PSP1的主要組分為葡萄糖、山梨糖、半乳糖、甘露糖，摩爾比為95.94∶1.59∶1.59∶0.88，而且具有典型的多糖特征吸收峰，并含有吡喃糖。結論 該方法簡便快速，多糖得率較高。

桑蠶蛹；多糖；超聲提取；水溶性多糖 （PSP1）；組分分析；Box-Behnken設計；響應面法；GC-MS

桑蠶蛹（mu1berry si1k-worm）［1-2］別名小蜂兒，為蠶蛾科動物家蠶蛾的蛹，在我國食用歷史悠久，因其含有多糖和豐富的蛋白質，具有提高免疫力、延緩衰老、降血脂、降膽固醇等多重功效，多用于體弱者、老人和孕婦產后恢復。近年來研究顯示，多糖具有抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血、免疫調節等生物學功效［3-4］。有文獻顯示，從桑蠶蛹中提取出的一種水溶性多糖具有抑制HeLa細胞增殖的作用［5］，但是未對其組分進行分析和確定。因此，本實驗采用超聲波法對桑蠶蛹多糖的提取工藝進行優化，并且對其中具有抗癌活性的多糖進行分離、純化和鑒定，分析了其單糖組成，以求為尋找天然產物作為腫瘤治療替代藥物的進一步研發提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料、試劑、儀器

1.1.1材料 桑蠶蛹子實體采自山東省臨沂市。G-150葡聚糖凝膠樹脂、二乙氨基乙基纖維52樹脂、SP131198纖維素透析袋 （上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖為分析純 （錦州市鑫源化玻有限公司）。

1.1.2試劑 石油醚、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇、重蒸酚、濃硫酸、吡啶、甲醇等均為分析純（錦州市鑫源化玻有限公司）。

1.1.3儀器 500 g搖擺式中藥粉碎機 （溫嶺市奧力中藥機械有限公司）；DHG-9075A鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；UV2550紫外可見分光光度儀 （日本島津公司）；Sigma高速冷凍離心機 （北京興達恒信科技有限公司）；GC7890B/ MSG3440B氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；A1pha傅里葉變換紅外光譜儀 （緯斯特儀器中國有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的制備 采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線，測定多糖含有量［6-8］。精確量取0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液 （制備方法為精密稱取于105℃烘干至恒重的葡萄糖0.100 0 g，蒸餾水溶解，定容于100 m L量瓶中。吸取10 mL，置于另一100 mL量瓶中，蒸餾水定容，即得。）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，分別置于比色管中，加蒸餾水至1.0 mL。分別加入1 m L 5%重蒸酚和5 m L濃硫酸，沸水浴加熱10 min，待反應完全后冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標 （Y），葡萄糖含有量為橫坐標 （X）繪制標準曲線，得回歸方程Y=1.293 7X+0.015 6（R2=0.998 6），表明葡萄糖在0.02～0.08 mg/m L范圍內線性關系良好。

1.2.2樣品的預處理 桑蠶蛹子實體于60℃烘箱中烘干后，粉碎機粉碎，過60目篩。取過篩后的桑蠶蛹粉末適量，索氏提取器按1∶9的比例加入石油醚回流5 h進行脫脂，再經95%乙醇回流提取5 h除去小分子醇溶物，將處理后的蠶蛹粉末于室溫下晾干。

1.2.3超聲波法提取桑蠶蛹多糖工藝優化［9］稱取一定量的預處理后的桑蠶蛹粉末，按一定比例加入0.02 mo1/L NaOH溶液［10］，超聲提取2次，合并濾液，HC1溶液調節pH值至中性，旋轉蒸發儀濃縮至一定體積后，加入4倍量95%乙醇，置4℃冰箱中過夜。醇沉液于4℃、3 000 r/min條件下離心20 min，干燥得桑蠶蛹粗多糖，計算得率。

1.2.3.1響應曲面法試驗設計 根據中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面分析法。在單因素試驗基礎上，以功率 （A）、時間 （B）、液料比 （C）為自變量，確定提取工藝的最佳參數，因素水平見表1。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

1.2.4桑蠶蛹多糖的脫色及除蛋白 將蠶蛹粗多糖用Sevag法除蛋白，4℃下5 000 r/min離心20 min，取上清液反復離心，直至無蛋白層出現為止［11-12］，活性炭脫色，經3層濾紙抽濾以除去活性炭粉末［13-14］。濾液經濃縮、醇沉、干燥，得到除蛋白及脫色后的桑蠶蛹多糖。取0.5 mg/mL樣品液于比色管中，加蒸餾水至 1.0 mL，按“1.2.1”項下方法于490 nm波長處測定吸光度，利用回歸方程計算脫色、脫蛋白后多糖的含有量，并計算490 nm波長處的保留率及450 nm波長處的脫色率。

計算公式為多糖含有量=純多糖質量/粗多糖質量×100%，多糖脫色率=（A1-A2）/A1× 100%，多糖保留率=（B1-B2）/B1×100%。其中，A1、A2分別為經脫色、脫蛋白處理前后桑蠶蛹多糖溶液在450 nm波長處的吸光度，B1、B2分別為經脫色、脫蛋白處理前后的桑蠶蛹多糖溶液在490 nm波長處的吸光度。

1.2.5桑蠶蛹多糖的純化 將脫色、脫蛋白后的多糖用蒸餾水溶解，裝入截留相對分子質量5 000 Da的透析袋中，在流動自來水中透析48 h，再置于蒸餾水中透析24 h。將透析后的多糖進行樹脂柱層析 （40 mm×400 mm），分別以超純水和0.2、0.4 mo1/L NaC1溶液為洗脫液，體積流量為0.5 mL/min，每管收集5 mL，苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定吸光度［15］，并繪制吸光度-試管數曲線。收集多糖PSP1洗脫液，濃縮、醇沉后于60℃烘箱中干燥。

查閱文獻可知，桑蠶蛹水溶性多糖 （PSP1）具有抑制HeLa細胞增殖的作用［5］，并能明顯增強B淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖，促進小鼠巨噬細胞的吞噬活力和溶血素生成［16］，但尚無化學方面的研究。因此，本實驗將在優化提取工藝的基礎上，對其組分進行分析。

1.2.6桑蠶蛹多糖PSP1的純化 將Sephadex G-150樹脂于沸水中溶脹2 h后裝柱，平衡液平衡層析柱5個柱體積。多糖PSP1經蒸餾水溶解后，上凝膠柱層析 （30 mm×300 mm），以超純水為洗脫液，體積流量為0.5 mL/min，每管收集5 mL，苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定吸光度，并繪制吸光度-試管數曲線，收集洗脫液，濃縮、醇沉后于60℃烘箱中干燥［17］。

1.2.7多糖PSP1的純度鑒定

1.2.7.1紙層析法 取0.2%PSP1多糖溶液20μL，點樣于濾紙（3 cm×20 cm）距端點1 cm處的中部，以正丁醇-乙酸乙酯-吡啶-水 （6∶1∶5∶4）為展開劑，飽和后于室溫下展開6 h，通風櫥中揮干溶劑。以苯胺-二苯胺為顯色劑，于60℃烘箱中放置20 min顯色［18］。

1.2.7.2紫外分光光度法 稱取少量多糖PSP1，溶解于適量蒸餾水中，紫外可見分光光度計在200～400 nm范圍內進行掃描。

1.2.8桑蠶蛹多糖PSP1的組分分析

1.2.8.1多糖的完全酸水解及硅烷化衍生 精密稱取桑蠶蛹多糖PSP1 10.0 mg，置于安瓿瓶中，加入3 mL 0.5 mo1/L硫酸溶液，酒精噴燈真空封管，置于110℃烘箱中水解6 h，冷卻至室溫后加入過量碳酸鋇粉末，靜置過夜，待其中和至中性后離心，上清液冷凍干燥，即得多糖水解產物，備用［19-21］。將水解產物于60℃下干燥至恒重，加入2 m L無水吡啶，置于80℃烘箱中反應30 min后，加入0.6 mL硅烷化試劑（六甲基二硅胺烷-三甲基氯硅烷為2∶1），搖勻，80℃烘箱中反應10 min［22-23］，過0.22μm有機濾膜，即得衍生化產物，備用。

1.2.8.2氣相色譜-質譜分析條件 氣相色譜EI源，電子能量70 eV；分子量掃描范圍30～600 u；進樣口溫度210℃；接口溫度210℃；載氣為氦氣；體積流量為1 m L/min；分流比60∶1；程序升溫（100℃保持5 min，以25℃/min速率升至210℃，保持14 min，以5℃/min速率升至290℃）；進樣量為0.5μL。質譜EI源，電子能量70 eV；溶劑延遲4 min。

1.2.9紅外分析 稱取干燥至恒重的桑蠶蛹多糖PSP1 1 mg，置于潔凈的瑪瑙研缽中，紅外燈下研磨成粉，加入200 mg干燥的KBr粉末，研磨至兩者完全混合均勻。將混合物置于潔凈的壓片模具中，組裝好后進行壓片，制成透明薄片。以空氣為空白，將薄片裝在樣品架上，置于樣品室中，在400～4 000 cm-1區間內進行紅外光譜掃描，先測定空白背景，再測定樣品的紅外光譜，進行修正后觀察譜峰情況［24-25］。

2　結果與分析

2.1Box-Behnken試驗設計與結果 見表2。

表2　試驗設計及結果Tab.2 Design and resu lts of tests

根據表2結果，利用Design Expert8.0軟件對數據進行二次回歸分析，得到回歸方程Y= 13.63+2.28A+1.50B-0.88C+0.54AB-1.19AC-0.38BC-2.87A2-0.98B2-1.34C2，方差分析見表3。由表可知，回歸方程模型的P＜0.000 1，高度顯著；R2為0.978 4，與實驗擬合較好，符合度達97.84%，可靠性高，線性關系顯著；R2adj值為0.950 7，能夠解釋95.07%響應值的變化，進一步證明其可靠性。另外，功率和時間對多糖得率影響較大，尤其以功率最為顯著，影響程度依次為功率＞時間＞液料比。

2.2響應面曲線圖 由圖1可知，功率較低時，得率隨時間和液料比的增加而提高，但功率較大時反而降低，即與功率和液料比有關，而且穩定點都落在范圍內，表明兩者的交互作用對得率也有影響。液料比較低時，得率隨時間的增加而提高。時間較長時，得率隨液料比的增加而呈降低趨勢。經軟件分析預測，該模型得率為15.53%，最優提取條件為超聲功率764.60 W，時間10.00 min，液料比11.22∶1。結合實際操作，將其修正為超聲功率760 W，時間10 min，液料比11∶1。為驗證結果的可靠性，按上述條件設計3次平行驗證實驗，測得桑蠶蛹多糖平均得率為15.28%，與預測值接近，說明該模型準確可靠。

表3　方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.3桑蠶蛹多糖的純化 經過石油醚脫脂、水提醇沉、Sevag法除蛋白、活性炭脫色后，得到淺黃色的桑蠶蛹粗多糖，其含有量為82.34%，脫色率為60.90%，保留率為49.68%。粗多糖經截留分子量5 000μ的透析袋透析，經DEAE-52樹脂純化。由圖2可知，多糖PSP1的峰值最高，而且峰形對稱。

2.4 桑蠶蛹多糖PSP1的純化及鑒定 Sephadex G-150樹脂柱層析的紫外圖譜 （圖3）顯示為單一的洗脫峰，洗脫曲線峰形對稱，表明多糖純度較高，分子量分布較均一。該多糖在紙層析上顯示為單一斑點，說明為單一組分。在260 nm和280 nm波長處沒有吸收峰，表明不含核酸和蛋白質。

2.5桑蠶蛹多糖PSP1的組分分析 桑蠶蛹多糖PSP1經硫酸酸解及硅烷化衍生后，再經氣相色譜-質譜 （GC-MS）檢測，供試品各峰保留時間與NIST譜庫對照結果見表4、圖4。由表可知，PSP1中有4種單糖，匹配度均在85%以上，以葡萄糖為主，其比例為95.94∶1.59∶1.59∶0.88。

圖1　響應面曲線圖Fig.1 Response surface curves

圖2　DEAE-52樹脂柱純化多糖Fig.2 Purification of polysaccharides by DEAE-52 resin column

圖3　G-150葡聚糖凝膠柱純化多糖PSP1Fig.3 Purification of polysaccharide PSP1 by Sephadex G-150 colum n

表4　組分分析結果Tab.4 Resu lts of component analysis

2.6紅外光譜解析 由圖5可知，3 600～3 200 cm-1處有一個較寬的吸收峰，為氫鍵中O-H鍵的伸縮振動峰；2 926.01 cm-1為C-H鍵的伸縮振動峰；1 419.61 cm-1為C-H鍵的變角振動吸收峰，由此可判斷 PSP1為 多 糖［26-27］。1 653.00 cm-1為O-H鍵的彎曲振動峰；1 384.89～1 419.61 cm-1為 C-H鍵的彎曲振動峰；1 026.13、1 080.14、1 151.50 cm-1為C-O鍵的伸縮振動峰；1 026.13、1 080.14 cm-1為吡喃糖環的特征吸收峰；869.90 cm-1為β-D-甘露吡喃糖苷δC-H鍵的振動峰［28-29］。

3　討論

本實驗通過響應面法優化桑蠶蛹多糖的超聲提取工藝，發現最優條件為超聲功率760 W，時間10min，液料比11∶1，平均收率為15.28%。采用硫酸酸解、硅烷化法對PSP1進行衍生，GC-MS顯示其單糖組分為葡萄糖、山梨糖、半乳糖和甘露糖，比例95.94∶1.59∶1.59∶0.88。今后，還將采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應、質譜、核磁共振等方法對其結構進行深入研究。

圖4　GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram

圖5　紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum

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Optim izing the ultrasonic extraction of polysaccharides from mulberry silkworm pupa and analyzing the water-soluble polysaccharide

TAN Li-he， LIHong-yu*

（Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

AIM To optimize the u1trasonic extraction of po1ysaccharides from mu1berry si1kworm pupa and to ana1yze the components of water-so1ub1e po1ysaccharide（PSP1）by gas chromatography-mass spectrometer（GCMS）and infrared spectroscopy（IR）.METHODS With the po1ysaccharide yie1d as amode1 for eva1uation，the u1trasonic extraction was optimized by Box-Behnken design and response surface method.After dia1ysis，PSP1 stratefied by the resin co1umn was qua1ified and quantified by GC-MSand IR.RESULTS At the highest po1ysaccharide yie1d of 15.28%，the best conditions were 760 W for u1trasonic power，11∶1 for 1iquid-so1id ratio，and 10 min for extraction time.Themain components of PSP1，presenting the typica1 characteristic absorption peaks of po1ysaccharides，were determined to be g1ucose，sorbito1，ga1actose andmannose at themo1ar ratio of95.94∶1.59∶1.59∶0.88，and with a concomitant pyranose.CONCLUSION This simp1e and rapid method can produce a high yie1d of po1ysaccharides.

mu1berry si1kworm pupa；po1ysaccharides；u1trasonic extraction；water-so1ub1e po1ysaccharide（PSP1）；componentana1ysis；Box-Behnken design；response surfacemethod；GC-MS

R284.2

A

1001-1528（2016）06-1254-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.011

2015-12-01

譚麗鶴 （1991—），女，碩士，研究方向為藥劑學。Te1：18841622145，E-mai1：1402334040@qq.com

李紅玉 （1956—），女，博士，教授，博士生導師，研究方向為載體栓劑及新藥開發。E-mai1：1ihongyu@163.com