參梅養胃顆粒質量標準的研究

陳 鐳， 郭 青（.南京中醫藥大學，江蘇南京20000；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇南京20000）

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參梅養胃顆粒質量標準的研究

陳 鐳1， 郭 青2*
（1.南京中醫藥大學，江蘇南京210000；2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇南京210000）

目的 建立參梅養胃顆粒 （蒲公英、甘草、土木香等）的質量標準。方法 TLC法鑒定蒲公英和甘草，HPLC法定性分析土木香內酯和異土木香內酯，并定量測定丹參素鈉和芍藥苷的含有量。結果 TLC鑒定專屬性強，陰性無干擾。4批樣品未檢出蒲公英，6批未檢出甘草，3批未檢出土木香內酯。丹參素鈉和芍藥苷分別在40.5～506.25μg（r=1.000）和50.19～627.38μg（r=0.999 5）范圍內線性關系良好，平均回收率分別為97.16%和99.83%，RSD分別為1.51%和0.62%（n=6）。兩者平均含有量分別為4.560 mg/袋和12.191 mg/袋，每袋含丹參和白芍不得少于3.5mg和9.4mg。結論 該方法簡便準確，專屬性強，可為參梅養胃顆粒質量標準的建立提供參考。而且，統一工藝制備的12批樣品均符合相關要求。

參梅養胃顆粒；蒲公英；甘草；土木香內酯；異土木香內酯；丹參素鈉；芍藥苷

參梅養胃顆粒由北沙參、山楂、烏梅、紅花、莪術、土木香、蒲公英、丹參、甘草、白芍、當歸11味藥組成，具有養陰和胃功效，用于治療胃痛灼熱、嘈雜似饑、口咽干燥、大便干結，以及淺表性胃炎、胃陰不足型慢性胃炎、各種胃部不適等癥［1］。目前，該制劑的質量標準仍局限于理化鑒別，項目簡單，水平低下，無法控制其質量，導致各生產廠家的產品在質量上相差迥異，市場上魚龍混雜。因此，有必要建立規范嚴謹的參梅養胃顆粒質量檢測方法及質量標準，對全國各廠家生產的產品進行質量統一要求。

參梅養胃顆粒為國家中藥標準提高行動計劃的目錄品種，本實驗在上述背景下，建立了對蒲公英、甘草定性鑒別的TLC法，土木香進行定性鑒別的HPLC法，以及丹參素和芍藥苷2種含有量較高的成分同時測定的HPLC法。此外，在各廠家對制成總量、制法工藝、得膏率多次反饋意見的基礎上進行統一，提出了該制劑通用、具有可控性的質量標準。

1　儀器與試藥

島津LC-20AB色譜儀；Agi1ent 1260色譜儀；ThermoFisher DIONEX色譜儀；JS-720超聲儀（720 W、40 Hz）；CPA224S、BS21S電子天平（德國Sartorius公司）；MX5電子天平（瑞士Mett1er To1edo公司）；TG16-WS臺式高速離心機 （長沙湘儀離心機儀器有限公司）；瑞士Camag Automatic TLC Samp1er 4點樣儀；TLC Visua1izer薄層成像系統。

甘草 （批號120904-201318）、蒲公英 （批號121195-200902）、丹參素鈉 （批號110855-201311，含有量≥98.1%）、芍藥苷 （批號110746-201108，含有量≥94.9%）、土木香內酯 （批號110760-201209，含有量≥98.4%），異土木香內酯 （批號110761-200204）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。共收集到6個廠家 （編號A～F）33批樣品，具體見表1。土木香、蒲公英、甘草、白芍、丹參陰性樣品均由南京同仁堂藥業有限責任公司提供。

表1　樣品信息Tab.1 Information of samples

2　方法與結果

2.1TLC鑒別

2.1.1蒲公英［2-3］取樣品 （批號 140302、20140123、20140402、20150205、150301）30 g，研細，加氯仿120 m L，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，1 mL氯仿溶解，作為供試品溶液。另取蒲公英0.5 g，同法制備，加甲醇5 mL溶解，作為對照藥材溶液。按照 《中國藥典》2010版附錄ⅥB，吸取上述兩種溶液各10～20μL，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚 （60～90℃）-苯-乙酸乙酯（5∶1∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈 （365 nm）下檢視，結果見圖1。由圖可知，供試品在與對照藥材色譜相應的位置處，顯示出相同顏色的紅色主斑點，缺蒲公英陰性樣品無相應斑點。同時，有4批樣品 （批號130908、130909、20140121、20140123）未檢出蒲公英，而統一工藝后的12批樣品全部檢出。

2.1.2甘草［4］取樣品 （批號同 “2.1.1”項）15 g，研細，加乙醚50 mL，加熱回流1 h，過濾，藥渣加甲醇30 m L，再加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加水40 m L溶解，正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次30 mL，蒸干，殘渣加甲醇2 m L溶解，作為供試品溶液。另取甘草1 g，同法制備，加甲醇5 mL溶解，作為對照藥材溶液。按照 《中國藥典》2010版附錄ⅥB，吸取上述兩種溶液各10μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水 （30∶10∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液，105℃加熱至斑點清晰，在日光下檢視，結果見圖2。由圖可知，供試品在與對照藥材色譜相應的位置處，顯示出相同顏色的黃色斑點，缺當歸陰性樣品無相應斑點。同時，有6批樣品 （批號140301、140302、140401、20140401、20140402、20140203）未檢出甘草，而統一工藝后的12批樣品全部檢出。

圖1　蒲公英TLC圖譜Fig.1 TLC ch romatogram of Taraxaci Herba

圖2　甘草TLC圖譜Fig.2 TLC chromatogram of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

2.2土木香HPLC法鑒別［3］取樣品 （批號140202）30 g，研細，加氯仿 120 mL、濃氨水4 mL，密塞，超聲30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇1 m L溶解，作為供試品溶液。另取土木香內酯、異土木香內酯對照品，加甲醇制成每1 m L含0.1 mg相應成分的溶液，作為對照品溶液。

色譜條件［5］為填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液 （50∶50）；檢測波長225 nm。分別吸取上述兩種溶液20μL，注入液相色譜儀，結果見圖3。同時，有3批樣品 （批號20150611、20150618、20150620）僅檢出異土木香內酯。

2.3HPLC法［6-9］測定丹參素鈉、芍藥苷含有量

2.3.1提取條件的選擇

2.3.1.1提取方法 精密稱取供試品1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲 （720W、40 kHz）與加熱回流分別提取45 min，取出，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心 （10 000 r/min）10 min，取上清液。精密吸取10μL，注入液相色譜儀測定。結果，兩種方法提取效果差異不大，從操作角度考慮，選擇超聲處理。

圖3　土木香HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram s of Inulae Radix

2.3.1.2 提取時間 精密稱取供試品1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，分別超聲30、45、60 min（720 W、40 kHz），取出，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心（10 000 r/min）10 min，取上清液。精密吸取10μL，注入液相色譜儀測定。結果，丹參素鈉、芍藥苷峰面積隨提取時間增加無顯著變化，故選擇提取時間為30 min。

2.3.1.3提取溶劑 精密稱取供試品1 g，共3份，置于3個具塞錐形瓶中，精密加入20%、50%、70%甲醇25 m L，相應溶劑補足減失的質量，搖勻，離心 （10 000 r/min）10 min，取上清液。精密吸取10μL，注入液相色譜儀測定。結果，丹參素鈉峰面積隨提取溶劑變化無顯著變化，而芍藥苷峰面積在50%甲醇中高于其他兩種溶劑，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.3.1.4料液比 精密稱取供試品1 g，共6份，置于6個具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇5、10、15、20、25、50 m L，密塞，稱定質量，超聲30 min（720 W、40 kHz），取出，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心 （10 000 r/min）10 min，取上清液。精密吸取10μL，注入液相色譜儀測定，結果見圖4。由圖可知，芍藥苷在25 mL溶劑量時峰面積減少，而丹參素鈉峰面積隨溶劑量增加而增加，故選擇20 mL作為最佳溶劑量，此時料液比為1∶20。

圖4　料液比考察結果Fig.4 Results of solid-liquid ratio tests

2.3.2色譜條件 Dikma P1atisi1 ODS色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動相為甲醇∶乙腈（2∶1，A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫（0～16 min，9%A；16～40 min，21%A）；柱溫30℃；檢測波長230 nm；體積流量1 mL/min。

2.3.3溶液的制備

2.3.3.1對照品溶液 精密稱取丹參素鈉、芍藥苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL分別含20、25μg相應對照品的混合溶液，即得。

2.3.3.2供試品溶液 取樣品 （批號20140119）研細，精密稱取1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲（720 W、40 kHz）30 min，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心 （10 000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.3.3.3陰性樣品溶液 取不含丹參、白芍的陰性樣品，再按 “2.3.3.1”項下方法制備，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1精密度試驗 精密吸取供試品溶液 （批號20140119）10μL，連續測定6次，測得丹參素鈉、芍藥苷峰面積RSD分別為0.4%、1.8%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4.2專屬性試驗 取對照品、供試品和陰性樣品溶液各10μL，注入HPLC色譜儀測定，結果見圖5，表明陰性樣品對檢測無干擾。

圖5　專屬性試驗結果Fig.5 Results of specificity tests

2.3.4.3線性關系試驗 分別精密吸取丹參素鈉、芍藥苷對照品溶液 2、5、8、10、12、15、20、25μL，以進樣量為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，可知兩種成分在各自范圍內線性關系良好。

表2　回歸方程和線性范圍Tab.2 Regression equations and linear ranges

2.3.4.4穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液 （批號20140119），在上述色譜條件下于0、4、8、12、16、20、24 h分別進樣。結果，丹參素鈉、芍藥苷峰面積RSD分別為0.7%、1.1%（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4.5重復性試驗 取同一批 （批號20140119）樣品，按 “2.3.3.1”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，平行6份。結果，丹參素鈉、芍藥苷含有量RSD分別為0.4%、1.7% （n=12），表明該方法重復性良好。

2.3.4.6加樣回收率試驗 精密稱取樣品6份，每份0.5 g，精密加入含丹參素鈉1.517μg/mL、芍藥苷3.042μg/mL的混合對照品溶液1 mL，揮干。按 “2.3.3.1”項下方法制備，精密吸取10μL，注入HPLC色譜儀中測定。結果見表3。

表3　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

2.3.4.7耐用性試驗［10］比較3根不同品牌的高純度硅膠鍵合C18柱，即Waters Symmetry（4.6 mm× 250 mm，5μm）、Shiseido AQ（4.6 mm×250 mm，5μm）、Dikma ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）。取同一份供試品溶液 （批號20140119），分別于上述色譜柱中進樣測定。結果，供試液均有較好的分離度，丹參素鈉、芍藥苷含有量RSD（n=3）分別為1.41%、1.18%。具體見表4。

表4　不同色譜柱耐用性試驗結果（m g/g，n=3）Tab.4 Results of durability tests for different colum ns（mg/g，n=3）

另取同一供試品溶液 （批號20140119），分別用3種不同品牌色譜儀實驗，即島津LC-20AB、Agi1ent 1260、ThermoFisher DIONEX，用Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）進樣測定。結果，供試液在不同品牌色譜儀上均有較好的分離度，丹參素鈉、芍藥苷含有量RSD（n=3）分別為1.82%、1.55%，具體見表5。

表5　不同儀器耐用性試驗結果（mg/g，n=3）Tab.5 Results of durability tests for different instruments（m g/g，n=3）

2.3.4.8理論塔板數的確定 （表6） 最終確定，丹參素鈉≥6 178、芍藥苷≥15 749，理論塔板數按丹參素鈉峰計算，應不低于5 000。

2.3.5含有量測定 取4個廠家12批樣品 （均為有糖型），按 “2.3.3.1”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入HPLC色譜儀中測定，結果見表7。

3　討論

3.1檢測指標的確定 采用HPLC-DAD法，流動相選擇5%～90%乙腈進行梯度洗脫，采集極性范圍較寬的成分信息。結果，信號較高的色譜峰有丹參素鈉、丹酚酸B、芍藥苷，由于丹酚酸B在不同洗脫條件下均于右側有干擾，故選擇丹參素鈉和芍藥苷作為檢測指標。

表6　理論塔板數Tab.6 Theoretical plate numbers

表7　含有量測定結果Tab.7 Results of con tent determ ination

3.2色譜條件的選擇 通過DAD檢測，丹參素鈉和芍藥苷均在200 nm波長處有末端吸收，但易產生雜質干擾。由于丹參素鈉在230、280 nm，芍藥苷在232、274 nm波長處有吸收，為兼顧兩者的靈敏度和分離效果，故選擇230 nm作為檢測波長。3.3 含量測定限度的制定 根據統一工藝后4個廠家12批樣品的數據 （有糖型16 g/袋，無糖型5 g/袋），丹參素鈉平均含有量為4.560 mg/袋，芍藥苷為12.191 mg/袋。根據3家廠家提供的白芍和丹參藥材中丹參素鈉和芍藥苷含有量測定的結果，兩者的平均實際轉移率［11］［丹參素鈉轉移率=（成品中丹參素鈉含有量/16）/（丹參藥材中丹參素鈉含有量×70/1 000），芍藥苷轉移率=（成品中芍藥苷含有量/16）/（白芍藥材中芍藥苷含有量×87.5/1 000）］分別為1 176% （丹參素可由丹參中其它成分在受熱時轉化而來［12］）和28%。如果按藥典規定白芍的最低1.2%投料，則芍藥苷限度為3.8 mg/袋。但企業實際使用的白芍中，芍藥苷含有量均較高 （不低于3.0%），如按照此含有量制定限度，則數值為9.4 mg/袋，丹參素鈉限度相應為3.5 mg/袋。最終規定，本品每袋含丹參以丹參素鈉 （C9H9NaO5）計，不得少于3.5 mg；含白芍以芍藥苷 （C23H28O11）計，不得少于9.4 mg。

3.4丹參素鈉轉移率過高的探討 文獻 ［13］報道，丹參含有多種酚酸類成分。其中，丹參素為咖啡酸的水解產物3，4-二羥基苯基乳酸，迷迭香酸為咖啡酸與丹參素酯化縮合而成，原紫草酸由2分子咖啡酸縮合后再繼續與1分子或2分子丹參素縮合形成紫草酸和紫草酸乙，其他寡聚咖啡酸類化合物結構中也都含有丹參素單元。由于參梅養胃顆粒采用水煎煮的制法工藝，在加熱條件下可水解成丹參素，使其含有量增加，故本實驗測定的不是藥材中本身的游離的丹參素。

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Quality standard for Shenmei YangweiGranules

CHEN Lei1， GUO Qing2*
（1.Nanjing University ofChineseMedicine，Nanjing 210000，China；2.Jiangsu Provincial Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210000，China）

AIM To estab1ish the qua1ity standard for ShenmeiYangweiGranu1es（TaraxaciHerba，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，Inulae Radix，etc.）.METHODS TLC was app1ied to identifying T.Herba and G.Radix.HPLC was used for the qua1itative ana1yses of a1anto1actone and isoa1anto1actone，and quantitative determination of sa1vianic acid A sodium and paeonif1orin.RESULTS Free from interference from the negative reference，the TLC identification disp1ayed its good specificity.T.Herba was not detected in four batches of samp1es，G.Radix was not found in six batches，and there existed no a1anto1actone in three batches.Sa1vianic acid A sodium and paeonif1orin showed good 1inear re1ationships within the ranges of 40.5-506.25μg（r=1.000）and 50.19-627.38μg（r=0.999 5）.The average recoveries were 97.16%and 99.83%with the RSDs of 1.51%and 0.62%（n=6），respective1y.The average contents of these two constituents were 4.560 mg/bag and 12.191 mg/bag，whi1e the content 1imits of Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma and Paeoniae Radix Alba were suggested no 1ess than 3.5 mg/bag and 9.4 mg/bag，respective1y.CONCLUSION This simp1e，accurate and high1y specificmethod can contribute to the estab1ishmentof qua1ity standard for Shenmei YangweiGranu1es.In addition，twe1ve batches of samp1es prepared by unified techno1ogy meet the re1ated requirements.

Shenmei Yangwei Granu1es；Taraxaci Herba；Glycyrrhizae Radix et Rhizoma；a1anto1actone；isoa1anto1actone；sa1vianic acid A sodium；paeonif1orin

R927.2

A

1001-1528（2016）06-1279-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.016

2015-12-01

陳 鐳 （1991—），男，碩士生，研究方向為中藥學。Te1：18913605202，E-mai1：chen5615@126.com

郭 青 （1964—），女，博士，主任藥師，研究方向為中藥學。Te1：（025）86632807，E-mai1：guoqing850@sohu.com