復方茜草片質量標準的研究

方樂敏， 楊 駿，2， 劉 云， 浦益瓊*， 張 彤*（.上海中醫藥大學，上海20203；2.上海市香山中醫醫院，上海200020）

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復方茜草片質量標準的研究

方樂敏1， 楊 駿1，2， 劉 云1， 浦益瓊1*， 張 彤1*
（1.上海中醫藥大學，上海201203；2.上海市香山中醫醫院，上海200020）

目的 建立復方茜草片 （茜草和新疆紫草）的質量標準。方法 TLC法對茜草和新疆紫草進行鑒別，HPLC法測定大葉茜草素含有量。分析采用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相甲醇-乙腈-0.2%磷酸 （25∶50∶25）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長250 nm。結果 TLC斑點清晰，分離度好。大葉茜草素在0.828 125～106μg/mL范圍內線性關系良好 （r=0.999 8），平均加樣回收率為96.66% （RSD=2.04%）。結論 該方法可用于復方茜草片的質量控制。

復方茜草片；茜草；新疆紫草；大葉茜草素

復方茜草片系上海中醫藥大學附屬龍華醫院的臨床經驗方，由茜草和新疆紫草2味中藥組成，用于改善肝硬化脾功能亢進引起的血小板減少癥和凝血功能障礙，短期效果明顯，現已成為協定處方，廣泛用于肝硬化脾功能亢進和免疫性血小板減少性紫癜 （ITP）的治療。該方以茜草［1］為君藥，取其涼血止血活血之功；新疆紫草［1］為臣藥，取其清熱解毒涼血之功效，以加強茜草的涼血效果，全方組方精簡，共奏涼血止血、清熱活血之功效，適用于血小板減少癥的治療，尤其對免疫性血小板減少癥有較好的療效。其中，蒽醌及其苷類為茜草的主要化學成分，此外還含有萘醌、萜類、己肽、多糖［2-4］等化合物，其藥理作用包括止血、升高白細胞、促進機體造血功能、抗癌活性［5-7］等；新疆紫草的主要化學成分為萘醌類化合物，其中紫草色素即為萘醌色素［8-9］，其存在形式多為結合成酯，脂溶性較好，具有電子傳遞作用，促進或干擾部分生化反應過程，表現多種生物活性［10］。此外，紫草中還含有多糖、酚酸、生物堿、單萜苯醌、苯酚、三萜酸、甾醇及黃酮等［11］成分，具有止血［12］、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、抗生育、促進創面愈合、抗血管新生、抑制表皮細胞過度增殖［13］等作用，臨床上用于治療銀屑病、扁平疣、過敏性紫癜、傳染性肝炎等癥。

為了更好地控制復方茜草片的質量，本實驗建立了其中大葉茜草素的HPLC測定方法，其簡便準確，重復性好。同時，還建立了該藥物的質量標準，從多方位、多角度形成了全面規范的制劑質控方法，保證了安全性與有效性，為同類藥物的質量標準研究提供了參考［14-15］。

1　儀器與材料

HP1100高效液相色譜儀（美國Agi1ent公司）；U1timate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，美國We1ch Materia1s公司）；BS124S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；XS105DU電子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）；SHJ-4水浴恒溫磁力攪拌器 （金壇市美特儀器制造有限公司）；KH-400KDB數控超聲波清洗器 （昆山禾創超聲儀器有限公司）；薄層硅膠板（Si1ica ge160，德國Merck公司）；WFH-203B三用紫外分析儀 （上海精科實業有限公司）；BJ-1A智能崩解儀 （天津創興電子設備有限公司）。

大葉茜草素對照品 （批號110884-200604）。茜草 （批號 121049-201003）、新疆紫草 （批號12430-200802）（中國食品藥品檢定研究院），均經上海中醫藥大學教學實驗中心中藥鑒定實驗室李俊松高級實驗師鑒定，符合藥典要求。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。復方茜草片（自制，批號20130701、20130702、20130703）。

2　方法與結果

2.1制法 取等量茜草和紫草，95%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，第1次10倍量乙醇，第2次8倍量乙醇，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇，干燥粉碎，得到總浸膏提取物。加入適量微晶纖維素和羧甲基淀粉鈉，混勻，以5%聚維酮-K30為黏合劑，濕法制粒，干燥，過20目篩整粒，再加適量硬脂酸鎂，壓制成1 000片，包薄膜衣，即得。按上述工藝，制備3批中試片劑樣品，批號分別為20130701、20130702及20130703。

2.2性狀 紅棕色薄膜衣片，除去薄膜衣后片芯

為棕色至深棕色，氣微，味苦。

2.3薄層鑒別

2.3.1茜草

2.3.1.1供試品溶液的制備 取本品1片，除去包衣，研細，置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲30 min，搖勻，濾過，濾液濃縮至1 mL，即得。

2.3.1.2對照藥材溶液的制備 取茜草0.5 g，按“2.3.1.1”項下方法制備，即得。

2.3.1.3對照品溶液的制備 取大葉茜草素對照品，加甲醇制成每1 mL含2.5 mg對照品的溶液，即得。

2.3.1.4陰性樣品溶液的制備 取處方中除茜草外的原比例藥材與輔料，按制備工藝方法制備，即得。

2.3.1.5方法和結果 吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF245薄層板上，展開劑為石油醚 （60～90℃）-丙酮 （4∶1），展開后取出，晾干，于波長365 nm條件下檢視，結果見圖1。由圖可知，供試品在與對照藥材和對照品相應的位置上，顯示出相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，證明該方法合理可行。

圖1　茜草的TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Rubia cordifolia L.

2.3.2新疆紫草

2.3.2.1供試品溶液的制備 同“2.3.1.1”項。

2.3.2.2對照藥材溶液的制備 取新疆紫草0.5 g，按 “2.3.1.1”項下方法制備，即得。

2.3.2.3陰性樣品溶液的制備 取處方中除新疆紫草外的原比例藥材與輔料，按制備工藝方法制備，即得。

2.3.2.4方法和結果 吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為環己烷-乙酸乙酯-冰醋酸 （6∶3∶1），展開后取出，晾干，結果見圖2。由圖可知，供試品在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯示出相同顏色的藍綠色斑點，陰性對照無干擾，證明該方法合理可行。

圖2　新疆紫草的TLC色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Arnebia euchroma（Royle）Johnst.

2.4檢查 按照 《中國藥典》2010年版一部 （附錄ⅠD）［1］片劑下各項規定，對3批樣品中的質量差異、崩解時限檢查法、微生物限度檢查進行研究。

2.4.1片重差異 取本品20片，精密稱定總質量，求得平均值，再分別精密稱定每片的質量。與平均值比較，三批樣品片重分別為 （0.319 1± 0.007 4）、（0.321 8±0.004 7）、（0.324 5± 0.005 6）g，差異均在±5%以內，符合要求。

2.4.2崩解時限 按照 《中國藥典》2010年版一部附錄 （XIIA）崩解時限檢查法［1］，要求中藥浸膏片應在1 h內全部崩解，取本品6片，按上述條件測得 3批樣品的崩解時限分別為 22、21、20 min，均在60 min內崩解，符合要求。

2.4.3微生物限度 按照 《中國藥典》2010年版一部附錄 （ⅧC）微生物限度檢查［1］，要求每1 g中藥片劑 （不含藥材原粉）中細菌數不得超過1 000個，霉菌和酵母菌數不得超過100個，不得有大腸桿菌。經檢驗，3批樣品均符合要求。

2.4.4重金屬和砷鹽檢查 取本品適量，分別按照 《中國藥典》2010年版一部附錄ⅨE第二法［1］和附錄ⅨF第一法［1］，檢查重金屬和砷鹽含有量。結果，3批樣品均符合要求。

2.5大葉茜草素的含有量測定

2.5.1系統適用性研究 分析采用U1timate XBC18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸 （25∶50∶25）；體積流量1 m L/min；檢測波長250 nm；柱溫30℃。在上述色譜條件下，大葉茜草素的色譜峰可達到基線分離，分離度與柱效均良好，陰性對照溶液在相同保留時間處未見吸收。見圖3。

2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取大葉茜草素對照品適量，加甲醇制成每1 mL約含0.01 mg對照品的溶液，即得。

2.5.3供試品溶液的制備 取復方茜草片20片，除去包衣，研細 （過3號篩），精密稱取0.1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，密塞后稱定質量，超聲20 min，放冷，乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，稀釋，即得。

2.5.4線性關系考察 精密稱取減壓干燥后的大葉茜草素對照品5.30 mg，置于5 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并定容，得1.06 mg/mL對照品母液。精密吸取適量，依次稀釋后分別得到0.828 125～106μg/mL的系列梯度對照品溶液。各吸取20μL，在 “2.5.1”項下條件進行測定。

圖3　HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram s

以峰面積積分值為縱坐標 （Y），大葉茜草素對照品的質量濃度為橫坐標 （X）繪制標準曲線，得回歸方程Y=80.117X-50.029，r=0.999 8。由此表明，大葉茜草素在0.828 125～106μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.5精密度試驗 取0.010 78、0.114 1、0.442 mg/mL對照品溶液，各精密吸取20μL，在“2.5.1”項色譜條件下測定峰面積。結果，RSD分別為1.08%、0.47%、0.11%，表明日內精密度良好。再取0.015 3、0.099 4、0.130 4 mg/mL對照品溶液，各精密吸取20μL，注入液相色譜儀中，連續5 d，在 “2.5.1”項色譜條件下測定峰面積。結果，RSD分別為 1.72%、1.61%、0.18%，表明日間精密度良好。

2.5.6重復性試驗 取同批樣品，平行6份，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.5.1”項色譜條件下測定。結果，其平均含有量為3.34%，RSD為0.80%，表明該方法重復性良好。

2.5.7穩定性試驗 取 “2.5.5”項下供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、10、12、24 h在“2.5.1”項色譜條件下測定峰面積。結果，RSD為0.17%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取樣品粉末9份，每份0.05 g，加入大葉茜草素對照品適量 （高、中、低質量濃度各3份），按 “2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.5.1”項條件下測定，結果見表1。

表1　加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests

2.5.9含有量測定 取3批樣品，按 “2.5.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20μL，在“2.5.1”項色譜條件下測定，并計算片劑中該成分含有量，結果見表2。

表2　含有量測定結果Tab.2 Results of content determ ination

3　討論

在對紫草進行薄層鑒別時，比較了不同展開劑（環己烷∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶5∶0.5∶0.1、環己烷∶乙酸乙酯∶乙酸=6∶3∶1）、不同型號及廠家的薄層板 （HSG和HSGF254，煙臺江友硅膠開發有限公司；TLC Si1ica ge160，德國Merck公司）的展開性能，發現最終確定的方法具有良好的專屬性和重復性，操作簡單，斑點清晰，分離效果良好。

本實驗考察了溶劑種類 （水、乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇）、提取方法 （加熱回流法、超聲法）、溶劑用量 （5、10、25、50 mL）、提取時間 （10、20、30 min）對片劑中大葉茜草素含有量的影響，最終確定文中最佳提取條件。

紫草的預實驗結果表明，提取溫度對β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和左旋紫草素提取效果的影響均較大［16-18］。亦有文獻 ［19］報道，很多市售紫草中兩者的實際含有量并不能達到藥典標準，故暫不將其列為質量標準的定量研究內容。

茜草的預實驗結果表明，多批茜草中羥基茜草素的含有量差異較大 （0.081%～0.173%），與文獻 ［20］報道一致，但該成分含有量較低，故在質量標準研究中也暫不將其作為定量指標成分。

本實驗建立了復方茜草片的質量標準，從不同角度全面規范了該制劑的質量控制方法，保證了安全性與有效性，為同類藥物的質量研究提供了參考。

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Quality standard for Compound Rubia Tablets

FANG Yue-min1， YANG Jun1，2， LIU Yun1， PU Yi-qiong1*， ZHANG Tong1*

（1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China；2.Shanghai Municipal Xiangshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200020，China）

AIM To estab1ish the qua1ity standard for Compound Rubia Tab1ets（Rubia cordifolia L.and Arnebia euchroma［Roy1e］Johnst.）.METHODS R.cordifolia and A.Euchroma were identified by TLC，and the content ofmo11ugin was determined by HPLC.The ana1ysiswas performed on a 25℃thermostatic C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5μm），with the mobi1e phase comprising ofmethano1-acetonitri1e-0.2%phosphoric acid（25∶50∶25）at a f1ow rate of1.0mL/min，and detection wave1ength was setat250 nm.RESULTS The TLC spots were c1ear and we11-separated.Mo11ugin showed a good 1inear re1ationship within the range of 0.828 125-106μg/mL（r=0.999 8）.The average recovery was 96.66%（RSD=2.04%）.CONCLUSION Thismeth-od can be used for the qua1ity contro1of Compound Rubia Tab1ets.

Compound Rubia Tab1ets；Rubia cordifolia L.；Arnebia euchroma（Roy1e）Johnst.；mo11ugin

R927.2

A

1001-1528（2016）06-1293-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.019

2015-09-06

上海市科學技術委員會中藥現代化專項 （11DZ1971500）；上海市衛生和計劃生育委員會青年項目 （20124Y002）

方樂敏 （1990—），女，碩士生，從事藥物新劑型和新技術研究。Te1：（021）51322685，E-mai1：diy430@163.com

浦益瓊 （1980—），女，講師，從事中藥新劑型研究。Te1：（021）51323068，E-mai1：puyiq@163.com張 彤（1972—），男，教授，從事中藥新藥研究。Te1：（021）51322318，E-mai1：zhangtdmj@hotmai1.com