HPLC法同時測定3種老鸛草中7種成分

曹 波， 尹海波， 賈曉晴， 邵 飛（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

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HPLC法同時測定3種老鸛草中7種成分

曹 波， 尹海波*， 賈曉晴， 邵 飛
（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

目的 建立HPLC法同時測定老鸛草Geranium wilfordii Maxim.、牻牛兒苗Erodium stephanianum W i11d.和野老鸛草Geranium carolinianum L.中沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷和槲皮素的含有量。方法 分析采用Agi1ent 5TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫；體積流量1 mL/min；檢測波長280 nm（0～32 min）、360 nm（32～62 min）；柱溫30℃。SPSS17.0軟件進行數據分析。結果3種老鸛草中7種成分含有量均依次為老鸛草素＞柯里拉京＞鞣花酸＞沒食子酸＞原兒茶酸＞金絲桃苷＞槲皮素。其中，沒食子酸、槲皮素含有量呈顯著性差異 （P＜0.05）。結論 7種成分含有量在牻牛兒苗和野老鸛草中相近，而在老鸛草中較低。

老鸛草；牻牛兒苗；野老鸛草；化學成分；HPLC

老鸛草藥材始見于 《滇南本草》［1］，《中國藥典》2015版規定其有3種不同來源，分別為牻牛兒苗Erodium stephanianum Wi11d.、老鸛草Geranium wilfordii Maxim.和野老鸛草Geranium carolinianum L.［2］，其主要化學成分包括黃酮、鞣質、有機酸和揮發油［3-4］。目前，對老鸛草藥材進行含有量測定的報道很多［5-10］，但鮮有對這3種老鸛草多指標成分測定及比較的研究［11］。為了能夠更加全面有效地評價三者的質量，本實驗采用HPLC法同時測定老鸛草藥材中7種活性成分沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷和槲皮素的含有量。

1　儀器與試藥

Agi1ent1100色譜儀，包括Chemstation化學工作站（美國Agi1ent公司）；電子天平（德國Sartorius公司）；超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素 （中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110831-200302、110809-200604、100081-200406）；柯里拉京、金絲桃苷 （上海源葉生物科技有限公司，批號分別為PM0529SA14、RA0504FA14）；老鸛草素、鞣花酸 （上海融禾醫藥科技有限公司，批號分別為100503、091227）。乙腈、磷酸為色譜純 （天津市科密歐化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為市售哇哈哈純凈水。21批藥材均為野生，經遼寧中醫藥大學尹海波教授鑒定分別為老鸛草G.wilfordii、牻牛兒苗E.stephanianum、野老鸛草G.carolinianum，樣品信息見表1。

表1　樣品信息Tab.1 Information of sam p les

2　方法與結果

2.1試樣的制備及色譜條件

2.1.1對照品溶液的制備［12］稱取沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、金絲桃苷、槲皮素對照品1.25、0.59、8.95、11.8、0.65、0.13mg，置于10 m L棕色量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。另稱取干燥至恒重的鞣花酸對照品7.25 mg，置于5 mL棕色量瓶中，二甲基亞砜溶解并定容［13］，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備［12］精密稱取3種老鸛草藥材粉末 （40目）2 g，置于圓底燒瓶中，并加入200 mL甲醇，回流提取1 h，共2次，合并濾液蒸干，甲醇定容至25 m L棕色量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3色譜條件 Agi1ent 5TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈 （A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～10 min，4%～5%A；10～15 min，5%～12%A；15～20 min，12%～14%A；20～30 min，14%～15%A；30～40 min，15%～21%A；40～50 min，21%A；50～60 min，21%～45%A；60～62 min，45%A）；柱溫30℃；檢測波長280 nm（0～32min）和360 nm（32～62 min）；體積流量1 mL/min；進樣量10μL。色譜圖見圖1。

圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2方法學考察

2.2.1線性關系 精密量取混合和鞣花酸對照品溶液各2.5 mL，置于5 mL棕色量瓶中，甲醇和二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，連續稀釋4次，即得一系列質量濃度溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣10μL分析。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標 （Y）進行回歸，結果見表2。

表2　7種成分的標準曲線Tab.2 Standard curves of seven constituents

2.2.2精密度試驗 分別取同一混合及鞣花酸對照品溶液，在 “2.1.3”項條件下重復進樣6次，測得沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.66%、 1.83%、 1.74%、1.55%、1.28%、1.69%、1.77%，表明儀器精密度良好。

2.2.3穩定性試驗 將供試品溶液 （S20）置于室溫下，于0、2、4、6、8、10 h進樣檢測，測得沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.59%、1.70%、 1.29%、 1.54%、1.12%、1.88%、1.59%，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.2.4重復性試驗 精密稱取藥材粉末 （S20）6份，按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項條件下測定，測得沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.47%、1.70%、1.20%、1.56%、1.04%、1.62%、1.53%，表明該方法重復性良好。

2.2.5加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的樣品藥材 （S20）9份，每份1 g，每3份為1組，每組按低、中、高質量濃度分別加入相當于藥材含有量50%、100%、150%的對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.3”項色譜條件下分析，結果見表3。

2.3結果與分析

2.3.1含有量測定 精密吸取供試品溶液10μL，在“2.1.3”項色譜條件下測定，結果見表4和圖2。

表3　加樣回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery tests

表4　含有量測定結果（mg/g）Tab.4 Results of content determ ination（mg/g）

2.3.2各成分含有量及總含有量平均值的比較

見圖3～4，采用SPSS 17.0軟件，對3種老鸛草中7種成分含有量進行統計學分析。結果表明，僅原兒茶酸（P=0.433＞0.05）、鞣花酸（P=0.374＞0.05）、槲皮素 （P=0.063＞0.05）符合正態分布。將三者進行方差齊性檢驗，發現原兒茶酸（P=0.269＞0.05）、鞣花酸 （P=0.804＞0.05）、槲皮素 （P=0.698＞0.05）均滿足，再進行方差分析，結果見表5～6。將不符合正態分布的其他4種成分進行Kruska1-Wa11is檢驗，結果見表7。

圖2　各成分含有量折線圖Fig.2 Line graphs of contents of various constituents

圖3　各成分含有量平均值直觀圖Fig.3 Visual diagram s of average contents of various constituen ts

圖4　各成分總含有量平均值直觀圖Fig.4 Visual diagram s of average total conten ts of various constituen ts

3　討論與結論

由圖2可知，3種老鸛草中7種成分含有量由高到低，依次為老鸛草素、柯里拉京、鞣花酸、沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷、槲皮素。其中，金絲桃苷和槲皮素為黃酮類成分，其他均為鞣質類成分。由圖3和圖4可知，不同產地老鸛草中各成分含有量平均值低于牻牛兒苗和野老鸛草，其總含有量平均值差異更明顯，而牻牛兒苗和野老鸛草基本相近。因此，老鸛草的質量可能不如其他2種。

表5　方差分析Tab.5 Analysis of variance

表6　多重比較結果Tab.6 Results of multip le com parisons

表7　非參數檢驗結果Tab.7 Results of non-parametric tests

采用SPSS17.0統計軟件，對3種老鸛草中7種成分含有量進行分析，發現三者沒食子酸 （P= 0.039＜0.05，表7）、槲皮素 （P=0.038＜0.05，表5）存在明顯差異。再對槲皮素成分進行多重比較分析，發現野老鸛草與老鸛草 （P=0.021＜0.05，表6）、牻牛兒苗 （P=0.032＜0.05，表6）組間差異有統計學意義，結合槲皮素含有量平均值（野老鸛草0.150 mg/g、老鸛草0.077 mg/g、牻牛兒苗0.083 mg/g）可知，野老鸛草中槲皮素成分含有量高于其他2種。

綜上所述，本實驗以7種成分含有量為指標，采用HPLC法對3種老鸛草進行定量比較研究，可為 《中國藥典》中該藥材用藥的準確性以及質量標準的制定提供一定參考依據。

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Simultaneous determ ination of seven constituents in three kinds of cranesbill by HPLC

CAO Bo， YIN Hai-bo*， JIA Xiao-qing， SHAO Fei
（School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional ChineseMedicine，Dalian 116600，China）

AIM To estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous determining the contents of ga11ic acid，protocatechuic acid，cori1agin，geraniin，e11agic acid，hyperoside and quercetin in Geranium wilfordii Maxim.，Erodium stephanianum Wi11d.and Geranium carolinianum L..METHODS The ana1ysiswas performed on an Agi1ent C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5μm），mobi1e phase was acetonitri1e-0.1%H3PO4with gradient e1ution，f1ow rate was 1 mL/min，detection wave1engths were set at 280 nm（0-32 min）and 360 nm（32-62 min），and co1-umn temperature wasmaintaned at30℃.SPSS17.0 software was used for data ana1ysis.RESULTS The contents of seven constituents in three kinds of cranesbi11were a11 in sequence of geraniin＞cori1agin＞e11agic acid＞ga11ic acid＞protocatechuic acid＞hyperoside＞quercetin.Among them，the contents of ga11ic acid and quercetin showed significant differeces（P＜0.05）.CONCLUSION The contents of seven constituents are simi1ar in E. stephanianum and G.carolinianum，which are 1ower in G.wilfordii.

Geranium wilfordii Maxim.；Erodium stephanianum Wi11d.；Geranium carolinianum L.；chemica1 constituents；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1338-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.027

2015-10-25

中醫藥行業科研專項 （201407002）

曹 波 （1990—），女，碩士生，研究方向為種質資源鑒定及中藥品質評價。Te1：13998416323，E-mai1：1156034502@ qq.com

尹海波 （1973—），男，博士，教授，研究方向為種質資源鑒定及中藥品質評價。Te1：（0411）87586003，E-mai1：yhb0528@sina.com