CUS致大鼠抑郁行為涉及TNF-α及IDO-HAAO通路激活

伏簫燕，李海燕，崔　婷，蔣青松，邱紅梅（重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶　400016）

CUS致大鼠抑郁行為涉及TNF-α及IDO-HAAO通路激活

伏簫燕，李海燕，崔婷，蔣青松，邱紅梅
（重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶400016）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.014.html

目的研究慢性不可預見刺激（chronically unpredictable stress，CUS）致大鼠抑郁行為與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（indole-2，3-dioxygenase，IDO）及3-羥氨苯甲酸雙加氧酶（3-hydroxyl amino acid oxygenase，HAAO）蛋白表達的關系。方法♂Sprague Dawley（SD）大鼠30只，隨機分為對照組和模型組，采用孤養結合CUS連續刺激28 d建立大鼠抑郁癥模型；以曠場實驗和被動游泳實驗評價大鼠抑郁行為，以Western blot法檢測大鼠前腦皮層和海馬TNF-α、IDO及HAAO蛋白表達。結果與對照組大鼠相比，模型組被動游泳實驗不動時間明顯延長（P＜0.01）、曠場實驗得分明顯降低（P＜0.01）、前腦皮層和海馬的TNF-α、IDO及HAAO蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）。結論CUS誘導大鼠產生抑郁行為，其機制可能與激活腦內TNF-α及下游IDO-HAAO通路有關。

抑郁癥；慢性不可預見刺激；腫瘤壞死因子α；吲哚胺2，3-雙加氧酶；3-羥氨苯甲酸雙加氧酶；細胞因子

抑郁癥是一種臨床常見的精神障礙性疾病，以少動、思維緩慢、興趣缺失、記憶力減退等為主要特征，嚴重者甚至出現自殺傾向［1］。抑郁癥發病機制復雜，涉及遺傳、環境、表觀遺傳學等眾多因素。研究顯示，單胺類神經遞質系統功能紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調、腦源性神經營養因子不足、氧化應激損傷等都與抑郁癥發生密切相關［2］。目前臨床常用的抗抑郁藥物如5-羥色胺（serotonin，5-HT）再攝取抑制劑、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）再攝取抑制劑等都是通過作用于單胺遞質系統相應靶點，調節突觸間隙遞質水平而發揮治療作用，但這類機制很難解釋其藥物延遲性效應。因此深入研究抑郁癥發病機制，尋找藥物治療新靶點迫在眉睫。

最新研究顯示，抑郁癥與免疫激活和炎癥因子的釋放增加密切相關［3］。臨床研究發現，抑郁癥患者血中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平明顯增高，動物實驗研究發現，腹腔注射脂多糖可誘導小鼠產生抑郁行為、TNF-α拮抗劑依那西普可明顯改善小鼠的抑郁行為［4-6］，提示免疫激活、炎癥反應及細胞因子釋放涉及抑郁癥的發生發展。TNF-α是一種由多核巨細胞產生的細胞因子，具有免疫調節、介導炎癥反應等功能。近年來研究發現，TNF-α在抑郁癥發生中發揮著重要作用。TNF-α作為一種重要的促炎因子，可誘導IL、INF等其他促炎細胞因子的生成和釋放，引起炎癥的級聯放大反應。吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是一種細胞內的含亞鐵血紅素的酶，在催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝過程中起著限速酶的作用［7］。生理狀態下，IDO呈低水平表達，但在免疫激活、炎癥或感染過程中，細胞因子如TNF-α釋放增多，可誘導其明顯表達并過度激活，催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝，使合成5-HT的色氨酸耗竭，5-HT生成減少，誘發和（或）加重抑郁癥［8-9］。目前，最新臨床和基礎研究結果均顯示，IDO過表達和（或）活性增強與抑郁癥的發生密切相關，但不足以證明炎癥因子、IDO與抑郁癥之間的相互關系［10-11］。同時，IDO過度激活的犬尿氨酸途徑還可生成大量3-羥犬尿氨酸，并在3-羥氨苯甲酸雙加氧酶（3-hydroxyl amino acid oxygenase，HAAO）的作用下代謝生成喹啉酸，3-羥犬尿氨酸和喹啉酸均具有神經毒性作用，也可能參與了抑郁癥的發生［12-13］。因此，本研究采用孤養結合CUS建立大鼠抑郁模型，觀察大鼠前腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α及IDO、HAAO表達變化是否參與了抑郁癥的發生。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級♂Sprague Dawley（SD）大鼠30只，體質量180～220 g，由重慶醫科大學動物中心提供，醫學動物許可證號：SYXK（渝）2012-0001。

1.2主要試劑與儀器BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術公司）；anti-TNF-α、anti-IDO、anti-HAAO抗體（英國Abcam公司）；ECL化學發光試劑盒（美國Pierce公司）；Sigma低溫高速離心機：德國 Sigma公司（型號：3K30）；臺式離心機：上海市安亭科學儀器廠（型號：TGL-16C）；超低溫冰箱：日本Sanyo公司；凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司（型號：170-1870）；Western blot垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1動物分組和模型建立♂ SD大鼠30只，5 只/籠，自由飲水和攝食，在室溫（25±1）℃、通風良好的環境下適應性喂養1周后，隨機分為對照組和模型組。對照組大鼠5只/籠，自由攝食飲水，不予刺激。模型組大鼠1只/籠，采用孤養結合CUS方式建立抑郁動物模型。參照本實驗室前期建模方法［14］，采用的刺激方式包括4℃冰水浴5 min，45℃熱水浴5 min，禁飲禁食24 h，潮濕墊料24 h，傾斜24 h，晝夜顛倒，電擊5 min，噪音3 h，閃頻3 h，水平振蕩10 min，夾尾1 min，共11種刺激，每天隨機給予1種刺激，連續刺激28 d，4 d內同種刺激不重復出現，使動物不可預知。

1.3.2被動游泳實驗（forced swim test，FST）參考文獻［15］并加以改進，測試時將大鼠放入高60 cm、直徑20 cm、水深30 cm的透明圓柱形玻璃缸內，維持水溫（24±1）℃。測試時間7 min，記錄后5 min大鼠累計不動時間。

1.3.3曠場實驗（open-field test，OFT）參照文獻［16］并加以改進，采用內壁為黑色的100 cm×100 cm×40 cm木質敞箱進行測定，木箱底部均分為25 個20 cm×20 cm的方格。實驗開始時將大鼠置于木箱底部中央格，觀察并記錄5 min內大鼠水平運動得分（四爪均進入的穿越格子數）和垂直運動得分（后肢直立次數）、理毛次數及大小便，將各項得分相加即為曠場實驗得分。實驗結束后，清理糞便并用酒精清潔敞箱，以免大鼠遺留氣味對下次測試的影響。實驗必須在安靜昏暗的環境下進行。

1.3.4皮層和海馬TNF-α、IDO、HAAO蛋白表達測定末次刺激24 h后，每組取大鼠5只，4%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，于冰浴上分離前腦皮層和海馬并置于EP管中，-80℃保存備用。測定時，將前腦

皮層和海馬組織取出并剪碎、碾磨、裂解、提取蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用Western blot方法檢測大鼠前腦皮層和海馬的的TNF-α、IDO、HAAO的蛋白表達。上樣量每孔30 μg，依次進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、室溫5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗 4℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫下孵育（TNF-α、IDO 1 h，HAAO 25 min），洗膜（HAAO需室溫下孵育三抗35 min后再洗膜），ECL顯色，凝膠成像儀成像后，用Image Lab軟件（Bio-Rad）分析結果。以β-actin為內參校正蛋白表達。

2　結果

2.1CUS對大鼠行為的影響被動游泳實驗結果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠被動游泳不動時間明顯延長（P＜0.01），見Fig 1A。曠場實驗結果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠曠場實驗得分明顯降低（P＜0.01），見Fig 1B。提示CUS成功誘導大鼠產生焦慮、絕望等抑郁樣行為。

Fig 1　Effect of CUS on rat behaviors in FST and OFT（±s，n=15）

2.2CUS對大鼠前腦皮層和海馬TNF-α蛋白表達的影響與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬TNF-α蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），見Fig 2。提示CUS致大鼠產生抑郁行為時，炎癥因子TNF-α表達明顯升高。

Fig 2　Effect of CUS on TNF-α protein expression in rat brain（±s，n=5）

2.3CUS對大鼠前腦皮層和海馬IDO蛋白表達的影響與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬IDO蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），見Fig 3。提示CUS誘導的抑郁癥大鼠腦內IDO表達明顯升高。

Fig 3　Effect of CUS on IDO protein expression in rat brain（±s，n=5）

2.4CUS對大鼠前腦皮層和海馬HAAO蛋白表達的影響與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬HAAO蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），見Fig 4。提示CUS抑郁大鼠腦內HAAO表達明顯升高。

3　討論

抑郁癥發病機制復雜，涉及單胺遞質系統功能和HPA軸功能紊亂、氧化應激損傷、神經營養因子表達下降、免疫調節異常等多種病理生理學改變，但機制尚未完全闡明。動物模型是研究抑郁癥發病機制和抗抑郁藥物的有效手段之一，其中CUS模型可模擬人在社會生活中遇到的各種不可預見刺激，是目前廣泛采用的動物研究模型之一［17］。本研究采用CUS建立大鼠抑郁模型，研究抑郁癥的其他相關發病機制。FST和OFT是評價大鼠抑郁行為的有效指標，FST通過檢測大鼠在狹小環境的不動時間，反映大鼠的絕望抑郁狀態；OFT通過檢測大鼠在新異環境中的探究行為，反映大鼠的焦慮抑郁狀態。本研究結果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠被動游泳實驗不動時間明顯延長、曠場實驗得分明顯降低，提示CUS誘導大鼠出現焦慮、絕望樣抑郁行為。

Fig 4　Effect of CUS on HAAO protein expression in rat brain（±s，n=5）

抑郁癥的“單胺遞質假說”和“細胞因子假說”都是目前比較公認的抑郁癥發病機制。前者認為突觸間隙的5-HT及NE水平低下是導致抑郁癥發病的重要原因；后者認為免疫激活、炎癥反應及細胞因子活化和釋放增多是抑郁癥發病的重要原因。Maes等［8］于2011年提出新的“5-HT假說”，認為免疫激活誘導IDO活化致色氨酸耗竭、5-HT合成不足及下游毒性代謝產物增加均參與了抑郁癥的發生。色氨酸是腦內合成5-HT的前體物質，主要通過兩條途徑進行代謝，即色氨酸-5-HT通路和色氨酸-犬尿氨酸通路。色氨酸羥化酶是腦內合成5-HT的限速酶，本實驗室前期研究已證實，色氨酸羥化酶表達下調參與大鼠抑郁癥的發生［18］。IDO是肝臟以外唯一可催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝的限速酶。生理情況下，IDO呈低水平表達，但當炎癥、感染等免疫激活時，細胞因子TNF-α、IFN-γ等的釋放可誘導IDO激活，催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝明顯增多，導致合成5-HT的前體物質色氨酸耗竭，進而致5-HT合成不足，參與抑郁癥的發生。Maes等［8］研究發現，抑郁癥患者細胞因子分泌明顯增多、IDO活性明顯增強；O'Connor等［5-6］發現，IFN-γ、TNF等炎癥細胞因子可上調IDO表達誘導小鼠的抑郁樣行為，而應用IDO拮抗劑1-MT可明顯抑制小鼠抑郁癥樣行為的產生。本研究結果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬TNF-α、IDO蛋白表達均明顯升高，提示CUS誘導大鼠抑郁行為與腦內免疫激活和炎癥因子釋放并誘導IDO激活密切相關。與此同時，犬尿氨酸途徑代謝產物也可能對神經細胞產生毒性作用。在色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑中，犬尿氨酸可在犬尿氨酸羥化酶的作用下代謝為3-羥犬尿氨酸，后者在3-羥基犬尿氨酸酶作用下代謝為3-羥氨苯甲酸，最后在HAAO作用下最終代謝為喹啉酸。3-羥犬尿氨酸和喹啉酸都具有明顯的神經毒性，前者可導致單胺氧化酶活性增強和氧自由基生成增多，加速單胺類神經遞質的代謝并加重機體的氧化應激損傷［19］；后者可作用于N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體，促進谷氨酸釋放，發揮興奮毒作用［20］。本研究結果顯示，與對照組大鼠相比，模型組大鼠前腦皮層和海馬HAAO蛋白表達明顯升高，提示CUS誘導大鼠抑郁行為與腦內HAAO過表達密切相關。

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TNF-α mediated activation of IDO pathway involved in mechanism of depression in rats induced by CUS

FU Xiao-yan，LI Hai-yan，CUI Ting，JIANG Qing-song，QIU Hong-mei
（Dept of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

AimTo investigate the relationship between the depression-like behaviors of rats induced by chronically unpredictable stress（CUS）and the protein expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α），indole-2，3-dioxygenase（IDO）and 3-hydroxyl amino acid oxygenase（HAAO）.MethodsThirty male Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into control group and model group.CUS plus solitary condition were used to establish the depression model.The open field test（OFT）and the force swimming test （FST）were used to evaluate the depression-like behaviors of rats；Western blot was used to determinethe protein expressions of TNF-α，IDO and HAAO in the prefrontal cortex and hippocampus of rats.Results Model group rats showed obvious depression-like behaviors with increasing immobile time in FST（P＜0.01）and decreasing locomotive activity in OFT（P＜0.01），and up-regulating the protein expression of TNF-α，IDO and HAAO in the prefrontal cortex and hippocampus significantly（P＜0.05），compared with control group rats.ConclusionThe depression-like behaviors of rats induced by CUS may be associated with the activation of IDO-HAAO pathway mediated by TNF-α.

depression；CUS；TNF-α；IDO；HAAO；cytokines

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.007

A

1001-1978（2016）05-0620-06

R-332；R322.81；R749.42；R977.3；R977.6

2015-12-26，

2016-01-28

國家自然科學基金資助項目（No 31400881）；重慶市教委科學技術項目（No KJ1400208）

伏簫燕（1992-），女，碩士生，研究方向：神經精神藥理學，E-mail：447811112@qq.com；邱紅梅（1978-），女，博士，副教授，研究方向：神經精神藥理學，通訊作者，E-mail：qiuhongmei@cqmu.edu.cn