左卡尼汀抑制NF-κB敏化TRAIL誘導神經膠質瘤細胞凋亡

楊秀偉，謝　靖，鐘　鳳，韓彥弢（青島大學1.藥學院、2.附屬醫院、.基礎醫學院、.口腔醫學院，山東青島　266000）

左卡尼汀抑制NF-κB
敏化TRAIL誘導神經膠質瘤細胞凋亡

楊秀偉1，2，謝靖3，鐘鳳4，韓彥弢3
（青島大學1.藥學院、2.附屬醫院、3.基礎醫學院、4.口腔醫學院，山東青島266000）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.028.html

目的探討左卡尼汀作為TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand）敏化劑，增強TRAIL對神經膠質瘤細胞誘導凋亡的效果，并對其敏化作用的機制進行研究。方法以U87為神經膠質瘤細胞模型，通過CCK-8檢測細胞活性，Annexin V-FITC/PI染色、caspase-3表達及活性等指標檢測細胞凋亡，通過RT-PCR、Western blot對NF-κB（nuclear factor kappa B）和c-FLIP（FLICE抑制蛋白）的轉錄與表達進行分析，沉默NF-κB，分析其與c-FLIP的關系。

結果TRAIL與左卡尼汀聯用，癌細胞存活率明顯下降，凋亡明顯上升；聯用組與對照組相比，c-FLIP的轉錄和蛋白表達以及NF-κB的轉錄均有明顯降低；沉默NF-κB證明其為c-FLIP上游因子。結論左卡尼汀與TRAIL可以產生協同作用，誘導U87細胞凋亡，其敏化機制與抑制NF-κB信號通路以及其下游c-FLIP表達有關。

左卡尼汀；TRAIL；NF-κB；c-FLIP；神經膠質瘤；凋亡

左卡尼汀是一種廣泛存在于機體組織內的氨基酸衍生物，是哺乳動物能量代謝必需的體內天然物質，主要分布在哺乳動物的骨骼肌以及心肌中。人體可以通過膳食補充左卡尼汀，肉類、禽類、魚類以及乳制品都富含左卡尼汀，而蔬菜和谷物中左卡尼汀的含量較少［1］。左卡尼汀主要功能是促進機體脂類代謝，在能量生成的過程中起著至關重要的作用，它可以協助活化的脂肪酸進入線粒體基質進行β氧化產生能量，并進一步輔助中間產物輸出線粒體，以防止中間產物的聚集［2］。近期研究表明，左卡尼汀除了參與能量代謝，還可以調控細胞的程序性死亡。Fan等［3］報道：左卡尼汀可以選擇性誘導肝癌細胞凋亡而對正常肝細胞沒有任何不良影響。截止目前，對左卡尼汀誘導癌細胞凋亡的機制，尚無深入研究。

多形性成膠質細胞瘤（GBM）被世界衛生組織分類為四級星形細胞瘤，占所有星形細胞瘤的50%，是一種極為普遍且極具侵襲性的惡性膠質瘤［4］。其治療措施包括手術、放療、化療等，但由于GBM的基因多樣性以及其復雜的分子病理，GBM患者會不同程度的對治療產生抵抗［5-7］。因此，目前治療惡性膠質瘤成為腫瘤領域的重大挑戰之一。近期已有研究發現：針對特異性分子信號通路的靶向藥物對惡性膠質瘤特別有效，可能成為膠質瘤治療的新熱點。目前，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）已經被認為是最具有潛力的治療GBM藥物靶點［8］。本研究中，探討了左卡尼汀作為TRAIL的敏化劑，增強TRAIL對GBM細胞誘導凋亡的效果，并對其敏化作用的機制進行了研究，旨在為臨床GBM的治療提供新的有效手段。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器人惡性膠質瘤細胞株U87購自American Type Culture Collection公司。左卡尼汀、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自Sigma公司，DMEM培養基購自 Invitrogen公司，所有抗體均購于 Santa Cruz Biotechnology，流式凋亡試劑盒購于BD Pharmingen公司，caspase-3活性測定試劑盒購于Keygen公司，Nuclear Extraction試劑盒購于 Active Motif。酶標儀為Tecan公司產品（型號Infinite M1000），流式細胞儀為BD Biosciences公司產品（型號FACSCanto），PCR儀為Thermofisher公司產品（型號GeneAmp 9700）。

1.2細胞培養U87培養于含有10% 胎牛血清、1 ×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素雙抗的高糖DMEM完全培養液中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。根據細胞培養情況，3～4 d傳代1次，取對數生長期、健康的細胞進行實驗。

1.3CCK-8法測定細胞存活率將細胞接種于96

孔板中，相應藥物處理后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液后將96孔板放入細胞培養箱孵育3 h。用酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度，計算各組細胞存活率。

1.4Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡將細胞接種至6孔板中，相應藥物處理后，用胰酶消化、離心、收集細胞沉淀，PBS重懸細胞并計數。取3×105個細胞，加入100 μL結合液，重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），置于室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5Western blot檢測蛋白表達收集細胞，預冷的裂解液（含1%NP 40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS、蛋白酶抑制劑cocktail，pH 6.8）每組100 μL冰上裂解10 min，12 000 r·min-14℃離心20 min收集上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。上樣10 μL，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃低溫條件下轉膜，NC膜以5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2h。將對應的特異性一抗按1∶200、β-actin按1∶1 000稀釋后，4℃孵育過夜。洗膜3次，加入辣根過氧化酶結合的二抗，37℃孵育1 h，洗膜3次，加入DAB顯色。圖像經Quantity One凝膠成像分析系統進行分析。

1.6NF-κB活性測試以Nuclear Extraction試劑盒（Active Motif）進行細胞核內成分提取。細胞用PBS清洗，離心收集細胞，取細胞沉淀備用。每20 μL細胞沉淀加入200 μL核蛋白抽提試劑A（含PMSF），混勻冰浴10～15 min，然后加入核蛋白抽提試劑B 10 μL，混勻后冰浴1 min，離心吸取上清即為核蛋白。NF-κB活性利用ELISA試劑盒按步驟進行檢測，用酶標儀在450 nm波長處測量OD值。

1.7Caspase-3活性檢測Caspase-3活性利用試劑盒測定（Keygen Biotech，Nanjing，China）。細胞以PBS緩沖液重懸，冰上孵育60 min，10 000×g離心1 min。收集上清與特異性酶底物在37℃下溫育4 h，利用分光光度計檢測450 nm處吸光度。

1.8細胞轉染將3條靶向p65/NF-κB基因的特異性siRNA轉入細胞，篩選出對p65/NF-κB表達抑制最有效的一條。轉染前取對數生長期細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/High Glucose培養液懸浮后，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中。Lipofectamine 2000用Opti-MEM預混后，靜置5 min，加入Opti-MEM稀釋后的p65/NF-κB siRNA和controlsiRNA并混勻，室溫靜置20 min。p65/NF-κB siRNA序列為 5'-GATGAAGACTTCTCCTCCATTGCGGACAT-3'（shRNA），control-siRNA序列為5'-TGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGC-3'，將混合物按分組加入含膠質瘤細胞的6孔板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，48 h后收集細胞進行試驗。

1.9定量PCR測試于轉染后48 h收獲細胞，每孔加0.5 mL TRIzol，按照TRIzol試劑說明書進行操作。測定紫外分光光度計260 nm/280 nm波長處的吸光度值，計算濃度，2%瓊脂糖電泳檢測總RNA的完整性。逆轉錄條件參照AMV酶說明書進行，PCR擴增應用ABI PRISM 7000 Sequence Detection系統（Applied Biosystems）進行檢測。引物序列如下（sense）5'-CGGACTATAGAGTGCTGATGG-3'以及（antisense） 5'-GATTATCAGGCAGATTCCTAG-3'。GADPH用作內參來定量PCR產物。

2　結果

2.1左卡尼汀增強U87細胞中TRAIL誘導的細胞凋亡首先檢測TRAIL以及左卡尼汀對細胞存活率的影響。如Fig 1A所示，當TRAIL濃度為100 μg·L-1處理細胞48 h，可以明顯降低細胞存活率（P＜0.05）。左卡尼汀對細胞存活率的影響如Fig 1B所示，左卡尼汀對細胞存活率的抑制呈現濃度依賴，與對照組相比較，20 mmol·L-1左卡尼汀處理48 h可以將細胞的存活率降低至（62.1±5.2）%。基于以上的結果，以50 μg·L-1TRAIL與10 mmol ·L-1左卡尼汀組合進行后續實驗。如Fig 1C所示，50 μg·L-1TRAIL與10 mmol·L-1左卡尼汀聯合處理細胞 48 h，細胞的存活率降至（49.2± 4.9）%。

利用流式細胞儀，對左卡尼汀與TRAIL聯合誘導凋亡的效果進行檢測。如Fig 2A所示，當TRAIL濃度為50 μg·L-1，不能夠在細胞中引起明顯的凋亡（P＞0.05）。但是當50 μg·L-1TRAIL與10 mmol·L-1左卡尼汀聯合給藥時，左卡尼汀可以明顯增強細胞對TRAIL誘導凋亡作用的敏感度，兩者聯用可以在細胞中引起明顯的凋亡（P＜0.05）。細胞的凋亡與caspase-3和PARP的活化緊密相關，因此，檢測了兩者聯用對caspase-3以及PARP活化狀態的影響。如Fig 2B所示，TRAIL與左卡尼汀聯用導致活化 caspase-3和 PARP的表達明顯升高。caspase-3的活化也進一步的被酶活性檢測結果所證實，如Fig 2C所示。

Fig 1　Effect of L-carnitine or/and TRAIL on cell viability

2.2左卡尼汀通過調節c-FLIP水平提高U87細胞對TRAIL的敏感度U87細胞的凋亡與c-FLIP的水平密切相關［10，16］，本研究檢測了左卡尼汀是否通過調節c-FLIP水平提高U87細胞對TRAIL的敏感度。如Fig 3A所示，50 μg·L-1TRAIL并未引起細胞內c-FLIP水平的明顯變化（P＞0.05），而10 mmol·L-1左卡尼汀也只是將細胞內的c-FLIP水平稍微下調（P＞0.05）。但是當兩者聯用，細胞中的c-FLIP水平呈現出明顯的下降（P＜0.05）。為了進一步證實以上結果，利用RT-PCR檢測了c-FLIP的mRNA表達水平。如Fig 3B所示，TRAIL與左卡尼汀聯合，明顯抑制c-FLIP的mRNA表達，表明左卡尼汀增強TRAIL誘導凋亡效果伴隨c-FLIP水平的下調。

Fig 2　Combinatory treatment with L-carnitine plus TRAIL induced apoptosis mediated via caspase-dependent pathway

Fig 3　Effects of TRAIL and L-carnitine on c-FLIP expression in U87 cells

2.3左卡尼汀抑制 U87細胞中 TRAIL誘導的NF-κB活化NF-κB對于細胞內c-FLIP水平起到關鍵的調節作用［10］，本研究檢測了TRAIL、左卡尼汀以及兩者聯用對NF-κB信號通路的影響。如Fig 4A所示，ELISA的檢測結果表明，100 μg·L-1TRAIL可以將NF-κB的核內轉運比例稍稍上調，而左卡尼汀可以稍微下調p65亞基的核內轉運。但是當二者聯用時，與對照組相比，NF-κB的活化顯示出明顯抑制（P＜0.05），提示左卡尼汀對于TRAIL誘導凋亡的敏化作用與NF-κB通路活化受阻有密切關系。

2.4沉默p65/NF-κB基因誘導U87細胞的神經毒性為了更直觀的顯示NF-κB信號通路抑制對于TRAIL誘導細胞凋亡的敏化作用，以shRNA沉默了p65/NF-κB基因。轉染48 h以后，對p65/NF-κB基因沉默的效果利用免疫印跡進行驗證，如Fig 4B所示，siRNA轉染可以明顯抑制p65/NF-κB的表達。MTT實驗結果表明，沉默p65/NF-κB基因可以明顯增強TRAIL對于U87細胞存活率的抑制（Fig 4C）。同時，RT-PCR和Western blot結果也表明，p65/NF-κB基因沉默明顯降低了 U87細胞內 c-FLIP mRNA以及蛋白的表達（Fig 4D）。以上結果顯示，抑制NF-κB信號通路的活化可以在U87細胞中增強TRAIL誘導的凋亡，這種敏化效果與c-FLIP蛋白的下調有關。

3　討論

多形性成膠質細胞瘤（GBM）是成人患者中最常見的腦部腫瘤，具有高侵襲性、高死亡率的特點，中位存活期只有14.6月［9］。由于分子病理異相性，GBM的治療相較于其他腫瘤尤其困難。為了改善預后，提高生存率，針對凋亡以及存活通路的一系列藥物已經被用于治療GBM，包括針對表皮生長因子的erlotinib與gefitinib，針對Akt通路的perifosine，針對mTOR靶點的temsirolimus，以及針對Bcl-2的gossypol。已有臨床前研究表明，人類TRAIL能在活體動物模型中抑制膠質瘤生長［10］，提示TRAIL具有應用于臨床治療的巨大潛力。但是，大部分膠質瘤細胞對TRAIL呈現出耐受，極大的限制了TRAIL的臨床應用。近10年來，一系列研究結果顯示，將TRAIL與其他抗癌藥物相結合，可以有效克服TRAIL耐受，提高治療效果。Saito等［11］發現將Temozolomide與TRAIL相結合可以明顯延長荷瘤小鼠的存活期。Lee等［12］也證實了一些天然產物可以與TRAIL聯用，提高膠質瘤細胞對TRAIL的敏感度。本項研究中，我們對左卡尼汀與TRAIL的協同作用進行了研究，并對其相關機制進行了探討。

Fig 4　L-carnitine-potentiated TRAIL-induced apoptosis partially dependent on activation of NF-κB

TRAIL通過與死亡受體DR4/TRAIL-R1以及DR5/TRAIL-R2相結合，引致DISC形成，從而激活caspase-8，誘導細胞凋亡。從DISC發出的凋亡信號可以被細胞內FLICE抑制蛋白（c-FLIP）所抑制。c-FLIP屬于death effector domain（DED）家族，是具有催化活性的沒有caspase-8/-10的同系物，并且已經被發現在多種腫瘤中呈現高表達，被認為是凋亡的抑制因子之一［13］。3種c-FLIP片段變體已經被鑒定為細胞內蛋白，包括55 ku的長型c-FLIP（L）、26 ku的短型c-FLIP（S）以及24 ku的c-FLIP（R）。當處于高表達狀態，所有3種c-FLIP都被認為可以作為抗凋亡蛋白，并且與 caspase-8/-10競爭，參與DISC的富集［9］。相反的，在生理條件下，c-FLIP呈現低表達，c-FLIP可以促進caspase-8的活化以及死亡受體介導的凋亡［9］。Kang等的研究表明，利用siRNA敲除c-FLIP可以增強TRAIL誘導的凋亡。以上研究都提示：對于TRAIL誘導的凋亡，c-FLIP起到至關重要的作用。與此前研究結果相吻合，我們的研究結果也發現，左卡尼汀對于TRAIL誘導凋亡的敏化效果與c-FLIP下調有密切關系。

已有研究顯示［14］：NF-κB信號通路參與調節不依賴生長因子的細胞增殖，抑制凋亡、無限復制、組織的侵襲以及轉移，與腫瘤的發生發展緊密相關。NF-κB信號通路在神經膠質瘤的發展中也起著重要作用，其活性增加與不良預后呈正性相關。另外，NF-κB信號通路活化與轉錄水平上的c-FLIP上調也呈正性相關。因此，抑制NF-κB信號通路已成為治療神經膠質瘤的方案之一。Jane等［15］發現Bortezomib與TRAIL聯用，可以對神經膠質瘤的生長產生協同抑制，其機制與抑制NF-κB信號通路活化有關。本研究也發現左卡尼汀可以有效地抑制U87細胞中NF-κB信號通路活化，且NF-κB信號通路抑制是左卡尼汀敏化TRAIL誘導凋亡的主要機制。

綜上所述，本研究表明左卡尼汀可以在神經膠質瘤細胞中增強TRAIL誘導的凋亡，其機制與抑制NF-κB信號通路及其下游c-FLIP表達有關。此結果為將左卡尼汀應用于神經膠質瘤臨床治療提供了理論依據。

（致謝：感謝青島大學國家實驗教學中心人體機能實驗室全體人員的幫助。）

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L-carnitine sensitizes human glioblastoma cells to TRAIL-induced apoptosis

YANG Xiu-wei1，2，XIE Jing3，ZHONG Feng4，HAN Yan-tao3
（（1.School of Pharmacy，2.the Affiliated Hospital，3.Basic Medical College，4.School of Stomatology，Qingdao University，Qingdao Shandong266000，China）

AimTo investigate the enhancing effect of L-carnitine as a sensitizer on tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand（TRAIL）-induced apoptosis in glioma cells.MethodsGlioma cell U87 was used as model cell line.Cell viability was determined by CCK-8，and apoptosis was assessed by AnnexinV-FITC/PI staining，caspase-3 activity and expression.The expression and transcription of nuclear factor kappa B（NF-κB）and FLICE inhibiting protein（c-FLIP）were measured by RT-PCR and Western blot. In addition，NF-κB was knockdown to analyze its regulating effect on c-FLIP expression.ResultsThe combination treatment with TRAIL and L-carnitine significantly inhibited cell proliferation and induced apoptosis.Compared with control，combinational treatment significantly suppressed the transcription and expression of c-FLIP as well as translocation of NF-κB. Through silencing NF-κB，NF-κB was found to act as upstream signaling to regulate c-FLIP.ConclusionL-carnitine sensitizes TRAIL-induced tumor cell apoptosis via suppression of NF-κB-dependent c-FLIP expression.

L-carnitine；TRAIL；NF-κB；c-FLIP；GBM；apoptosis

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.014

A

1001-1978（2016）05-0664-07

R329.25；R730.264；R739.41；R977.4

2016-01-25，

2016-02-20

國家自然科學基金資助項目（No 81473384）

楊秀偉（1978-），女，碩士，藥師，研究方向：腫瘤防治，E-mail：qdzhfeng01@163.com；韓彥弢（1964-），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：天然藥物抗腫瘤，通訊作者，E-mail：hanyt19@126.com