抑郁大鼠海馬組織的比較蛋白質組學研究

曹莉莎，張　芳，羅　文，陳　靜，何淼泉，王繼生（綿陽市第三人民醫院臨床藥學科，四川綿陽　621000）

抑郁大鼠海馬組織的比較蛋白質組學研究

曹莉莎，張芳，羅文，陳靜，何淼泉，王繼生
（綿陽市第三人民醫院臨床藥學科，四川綿陽621000）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.040.html

目的比較慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）大鼠與健康大鼠的海馬組織，篩選差異表達蛋白質。以期從蛋白質組學角度闡明其發病機制，并為尋找生物標志物提供靶標。方法采用CUMS建立大鼠抑郁模型。運用8標ITRAQ技術，結合2D LC-MS/MS分析CUMS大鼠與健康大鼠的海馬組織差異表達蛋白質。

結果共鑒定出5 109個蛋白，差異蛋白33個，其中8個蛋白表達上調，25個蛋白表達下調。結論ITRAQ結合LCMS/MS技術能快速有效地進行蛋白質組學研究，為我們研究抑郁癥的發生、發展機制以及發現新的生物標志物提供了有力平臺。

ITRAQ；蛋白質組學；抑郁；海馬組織；質譜；CUMS

抑郁癥（depression）是一種表現為抑郁心境低落的綜合征，以心境低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為主要特征，嚴重后果的患者可能引起自殺。目前，關于抑郁癥的發病機制存在著很多假說，如單胺神經遞質及其受體學說、下丘腦-垂體-腎上腺（PHA）軸功能失調學說、神經營養因子學說等。但沒有一種學說能完全解釋抑郁癥的發病機制，發病機制的不清，導致診斷不明確，誤診和漏診率較高，對抑郁癥的治療也存在藥效延遲、部分抑郁患者療效不佳、復發率高等現象。因此，我們必須更好地了解抑郁癥的發生和進展機制，從而能夠有效地對抑郁癥進行徹底治療。研究發現，抑郁患者會出現記憶下降、學習能力降低等情況，而海馬與學習記憶有著密切關系。因此，研究海馬組織對于研究抑郁癥的發病機制有著重大的意義［1］。前期的實驗結果及參考文獻，引出本文蛋白質組學研究。

抑郁癥的發生和進展過程包含了細胞內多種信號通路的協同改變，研究這些機制的有效辦法就是從整體角度思考這些復雜的變化。蛋白質組學通過對整體蛋白質的大規模分析，研究生物學過程相關蛋白質的表達和功能的改變［2］。同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，ITRAQ）聯合液相色譜串聯質譜（LCMS/MS）是近年來開發的一種新的蛋白質組學定量技術，可同時對多達8種樣品進行定量研究，并且與傳統蛋白質組學研究相比較，ITRAQ技術中運用的定性和定量方法重復性更好，特別適用于低峰度蛋白質的研究，而且能夠通過同位素標記的方法，準確把握差異表達蛋白的動態變化，能夠更好地對蛋白質含量進行定量測定［3］。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級♂SD大鼠20只，體質量180～220 g，從重慶醫科大學實驗動物中心購買，合格證書編號SCXK（渝）2012-0001。實驗室環境為25℃，給予所有大鼠正常飲食、飲水，實驗室內黑暗與光照交替出現，黑暗12 h，光照12 h，所有大鼠飼養1周以適應環境。

1.2試劑與儀器H2O（HPLC級別）（美國Sigma公司），ITRAQ標記試劑盒（美國Applied Biosystems公司），BCA試劑盒（中國碧云天公司），胰酶（美國Sigma公司），Cocktail蛋白酶抑制劑（美國羅氏公司），全蛋白提取試劑盒（上海生工），蛋白裂解液（中國碧云天公司），尿素（美國Sigma公司），Anti-GABA Transporter（ab431），聚偏氟乙烯膜（PVDF）0.45 μm（Merck Millipore，IPVH00010），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（碧云天生物技術研究所，P0015），魯米諾化學發光液底物100 mL（Merck Millipore，WBLUC0100），TBST緩沖液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），電泳/電轉儀（Bio-Rad公司，041BR88778）。曠場實驗行為測試儀、強迫游泳行為測試儀、高架十字迷宮（重慶醫科大學藥理實驗室制）。低溫冰箱（-20℃）（德國西門子），Aallegra臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司），超低溫冰箱（-80℃）（美國Thermo Fisher），高效液相色譜儀（島津半制備型HPLC系統），RVT4104低溫冷凍干燥器（美國Thermo Fisher），SpeedVac真空離心器（美國Applied Biosystems公司），MALDI/TOF/TOF5800蛋白分析儀及配套軟件Mascot軟件（美國Applied Biosystems公司）。

1.3方法

1.3.1慢性溫和不可預見性應激大鼠模型♂SD大鼠20只，先進行曠場實驗評分，采用隨機區組設計，按曠場實驗結果將其分為正常組和模型組，每組10只。正常組正常飼養，模型組孤立喂養并接受21 d各種不同溫和刺激，包括禁水24 h、禁食24 h、4℃冰水游泳5 min、晝夜顛倒、熱刺激（45℃，5 min）、濕墊料、異味刺激、45°鼠籠傾斜24 h，每天隨機選擇1種刺激，相同刺激不得重復出現，同種刺激不能超過3次。造模完成后，即d 22時，進行曠場實驗、強迫游泳實驗、高架十字迷宮等行為學實驗，以判斷造模是否成功。模型成功后，大鼠斷頸處死，冰臺上迅速分離出海馬組織，液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.3.2海馬組織蛋白質的提取① Lysis buffer中加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL PMSF混勻。②冰上預冷玻璃勻漿器，2支lysis buffer。③取凍存的大鼠海馬組織，每組3只，PBS清洗，按組放入玻璃勻漿器，分別加預冷的 lysis buffer，手動研磨，至均質勻漿。④ 加入TCA-冰丙酮，-20℃沉淀2 h后，3 000×g，4℃，離心30 min，棄上清液，取沉淀。再加入丙酮，-20℃沉淀30 min，4℃，離心30 min，反復操作，至沉淀變為白色。-80℃凍存。

1.3.3ITRAQ標記①蛋白溶解，定量：取凍存的2組樣品，各加入40 mL裂解液和20 mL變性劑，震蕩混懸溶解，離心去除沉淀。用Bradford法進行蛋白定量，調整溶液的蛋白濃度，使每組蛋白樣品量為40 μg，體積20 μL。②還原，封閉：按試劑盒提供方案進行還原、封閉。③酶解：向各組蛋白溶液中加入1 μg胰酶，37℃溫育16 h。④標記：各試管標記試劑中加入50 μL異丙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應1 h，之后各加入3倍體積水，使標記試劑分解。真空冷凍干燥。⑤ 除鹽：將相關buffer和標記試劑的鹽除去。

1.3.4肽段的分離和鑒定①第一維強陽離子柱（SCX）分離：流動相A液：10 mmol·L-1KH2PO4，25%CAN，pH=2.6；B液：10 mmol·L-1KH2PO4，350 mmol·L-1KCl和25%ACN，pH=2.6。80 μL A液中溶解凍干樣品，上樣。將紫外檢測波長設置為214 nm/280 nm，然后將流速設置為200 μL· min-1。線性梯度洗脫：5～40 min，5% ～25%B；40 ～45 min，25% ～80%B；45～50 min，80%B；50～60 min，0%B。根據峰形和時間共收取20個梯度，真空離心濃縮后，每餾分用50 μL反相液相色譜的A相溶解，進樣量20 μL。②第二維反相液相色譜：流動相A液包含：5%（體積分數）乙腈和0.1%甲酸溶液。流動相B液包含：95%乙腈和0.1%甲酸溶液。RPLC柱線性梯度洗脫：0～5 min，上樣；5～70 min，5%～35%B；70～75 min，35%～80%B；75～80 min，80%B；80～81 min，80%～5%B；90 min停止。③質譜鑒定：噴霧針直接連接于反相色譜柱末端作為噴霧接口，噴霧電壓2.2 kV。MS掃描范圍：400～1 800 m/z，一個譜圖選擇4個最強母離子進行串級掃描，MS/MS掃描范圍100～2 000 m/z。

1.3.5生物信息學鑒定利用Protein.pilot3.0軟件檢索質譜分析所得數據，差異蛋白篩選標準設定為：①肽段≥3，②模型組與正常組大鼠海馬組織蛋白分子質量比≥2.0或≤0.5，③P＜0.05。運用Uniport軟件分析各蛋白生物學過程及分子功能，運用DAVID軟件從生物過程、細胞成分、分子功能注釋對蛋白進行分類，選擇KEGG數據庫對蛋白所涉及的通路進行分類和富集分析。

1.3.6Western blot驗證通過文獻檢索，選擇了差異蛋白 Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3進行Western blot驗證。按照碧云天SDSPAGE凝膠試劑盒提供配方制備凝膠；選取凍存大鼠海馬組織，每組3只，提取蛋白并定量，調整每管蛋白濃度至均值，加入含2-巰基乙醇和溴酚藍的2×蛋白上樣緩沖液，100℃孵育10 min，冷卻到室溫后，將變性蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內；蛋白上樣后電壓設置在100 V，時間設定為90～120 min，當溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳；然后經過轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，按1∶1加入AB顯影液，室溫放置5 min后，吸盡膜上水分，將膜放入暗盒，曝光5 min，在Bio-Rad的化學發光成像儀上顯影，然后分析灰度值，再計算灰度系數比。

2　結果

2.1行為學實驗結果根據前期的研究結果顯示［4］，21 d造模后，在曠場實驗中，模型組大鼠水平運動和垂直運動次數較正常組減少。在強迫游泳實驗中，模型組大鼠禁止不動時間較正常組增加。在高架十字迷宮實驗，模型組大鼠進入開臂的次數及停留時間百分率明顯縮短，進入高架十字迷宮總次數明顯減少。說明CUMS致大鼠出現抑郁行為。

2.2ITRAQ實驗結果根據設定的 Protein.pilot3.0軟件，共鑒定到5 109個蛋白，其中差異蛋白33個，模型組較正常組表達上調的蛋白8個，下調的蛋白25個。Uniport數據庫分析各個蛋白生物學過程及分子功能，見Tab 1。

2.3生物學功能分析通過DAVID富集分析系統對本實驗獲得的33種差異蛋白進行GO分析和pathway分析。對差異蛋白進行GO分析，研究這些蛋白的功能，BP分析發現差異表達蛋白大多參與物質的代謝、能量的產生、機體免疫及神經沖動的傳導。MF分析揭示這些蛋白大多數與體內分子的結合與捆綁相關，CC分析得出差異蛋白主要分布在細胞膜和線粒體上（Fig 1）。通過KEGG PATHWAY發現，共有23個蛋白，參與了7個生物代謝通路，有7個蛋白參與了檸檬酸循環，6個蛋白參與了丙酮酸代謝，4個蛋白參與了糖酵解和糖異生，5個蛋白參與了鈣信號途徑，5個蛋白參與了亨廷頓舞蹈癥，4個蛋白參與了帕金森病，4個蛋白參與了阿爾茨海默病。

2.4Western blot實驗結果ITRAQ實驗結果顯示，蛋白Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3在CUMS大鼠海馬組織中表達上調3.05倍。Western blot實驗結果表明，相對于正常大鼠海馬組織蛋白，Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3在CUMS大鼠海馬組織中明顯高表達。見Fig 2。

3　討論

抑郁癥是臨床常見的精神障礙性疾病，發病率逐年增加。目前藥物治療是抑郁癥的主要治療手段，但經過藥物治療的患者存在著復發率高，治療不徹底的現象。因此研究抑郁癥的發病機制，尋找更有效的藥物，是國內外一個重要的研究方向。ITRAQ技術作為一種新的蛋白質組學研究方法，在蛋白質定量方面顯出無可比擬的優越性，運用該技術尋找和發現CUMS大鼠海馬組織區別于正常生理狀態下的疾病特異表達蛋白，有利于疾病發病機制的闡明及尋找生物標志物。Chung等［5］運用ITRAQ聯合LC-MS/MS技術尋找出了人類肺腺癌潛在的生物標志物AGR2。

Fig 1　Rat hippocampus proteome classified according to GO annotations

Tab 1　Differentially expressed proteins between CUMS group and normal control group

Fig 2　P31647 expression in rat hippocampus revealed by Western blot analysis

本實驗運用慢性不可預見性溫和應激建立大鼠抑郁模型，該模型是一種經典的動物抑郁模型，被國內外實驗室廣泛使用，能模擬出人類抑郁的核心癥狀，與人類抑郁發病機制較為接近［6］。行為學結果顯示：曠場實驗中，模型組大鼠水平運動和垂直運動次數較正常組減少。強迫游泳實驗中，模型組大鼠禁止不動時間較正常組增加。高架十字迷宮實驗，模型組大鼠進入開臂的次數及停留時間百分率明顯縮短，進入高架十字迷宮總次數明顯減少。說明CUMS致大鼠出現抑郁行為。

本實驗運用ITRAQ技術結合2D LC-MS/MS分析CUMS大鼠與健康大鼠的海馬組織差異表達蛋白質。共鑒定出5 109個蛋白，差異蛋白33個，其中8個蛋白表達上調，25個蛋白表達下調。GO分析發現參與神經沖動傳導的蛋白共6個，其中表達上調的是Myelin proteolipid protein；表達下調的有Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Neurocan core protein、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3。參與神經遞質運輸的蛋白有4個，其中表達上調的蛋白是 Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3；表達下調的蛋白有Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A。參與突觸傳導的蛋白是Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Neurocan core protein、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3，都表達下調并且也參與了細胞間信號的傳導。參與調節神經遞質水平的蛋白共有3個，都表達下調，蛋白包括Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A。本實驗發現蛋白 Neurocan core protein、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3參與了3種生物學過程，Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A參與了5種生物學過程。并且蛋白Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Neurocan core protein、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3分別在CUMS大鼠海馬組織表達是正常大鼠的19%、35%、44%、13%、13%。這些蛋白表達的降低與抑郁癥的發生、發展有著密切的關聯。Abumaria等［7］的研究中也發現抑郁樣癥狀的大鼠synaptic vesicle glycoprotein 2b蛋白會減少。Dimatelis等［8］通過ITRAQ聯合MALDI-MS/MS實驗發現，與突觸可塑性相關的Neurocan core protein參與調節大鼠母嬰分離所帶來的焦慮及抑郁癥狀。Baker等［9］也證實，Synaptotagmin-1與人類運動的控制及認知的發展密切相關。

KEGG PATHWAY分析發現，CUMS大鼠海馬組織與三羧酸循環相關的7個蛋白Dihydrolipoyl dehydrogenase、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、2-oxoglutarate dehydrogenase、Pyruvate carboxylase、Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta、Aconitate hydratase、Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex均是低表達，這些蛋白的表達下調主要影響三羧酸循環的正常進行，在能量供給方面發揮著負面作用，與抑郁癥的發生發展密切相關。與Kaibara等［10］的研究結果相符。參與了鈣信號通路的5個蛋白Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2、Sodium/calcium exchanger 2、ADP/ATP translocase 2、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3、Isoform 2 of calcineurin subunit B type 1，均是低表達。Gavi?o等［11］的研究顯示，突觸前膜鈣通道和鈣流入的減少會導致突觸穩態的自我調節功能減弱，繼而影響到學習記憶睡眠質量的降低。隨之可能帶來精神方面的負面影響，引起抑郁。本實驗發現蛋白 ADP/ATP translocase 2、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3、AP-2 complex subunit beta參與了亨廷頓舞蹈癥，蛋白 ADP/ATP translocase 2、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3參與了帕金森病，而蛋白Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2、Isoform 2 of calcineurin subunit B type 1、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］ flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6參與了阿爾茨海默病。這3種疾病都是由于神經變性疾病引起的大腦退化性疾病，并且當病情發展到一定程度都會引起抑郁癥狀的發生［12］。本實驗發現參與這3種疾病代謝通路的蛋白表達均降低，并且蛋白ADP/ATP translocase 2、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3參與2種疾病的代謝通路，而蛋白 Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6甚至參與了3種代謝通路。這些參與2種，甚至3種的蛋白質會不會是引起神經退行性病變的關鍵蛋白，從而引導其他蛋白進入相應的代謝通路，值得我們進一步研究，從而尋找抗抑郁藥物的靶蛋白，并以此為基礎研發新型的抗抑郁藥物。

（致謝：本項目是在重慶醫科大學完成。感謝重慶醫科大學為本實驗提供的儀器設備的支持，及技術上的幫助。感謝實驗過程中給予過無私幫助的老師及同學們。）

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Analysis of CUMS-induced differentially
expressed proteins in rat hippocampus by ITRAQ

CAO Li-sha，ZHANG Fang，LUO Wen，CHEN Jing，HE Miao-quan，WANG Ji-sheng
（Dept of Clinical Pharmacy，the Third Hospital of Mianyang，Mianyang Sichuan621000，China）

AimsTo compare hippocampus between CUMS rats and normal rats，to find differentially expressed proteins and to explore the pathogenesis of depression in the protein levels and biological marker. MethodsChronic unpredicted mild stress was taken to establish rat depression model.The ITRAQ-labeled proteins and peptides were separated by the cation column，and differentially expressed proteins were detected and identified by 2D LC-MS/MS.The functions of proteins were analyzed by bioinformatics.ResultsTotally 5 109 proteins were identified，33 differentially expressed proteins were identified，the expressions of 8 proteins were increased and 25 proteins downregulated. ConclusionITRAQ based sereening is effective in discovering the nosogenesis of depression and new biological marker.

ITRAQ；proteomics；depression；hippocampus；mass spectrum；CUMS

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.020

A

1001-1978（2016）05-0697-06

R-322；R322.11；R341；R749.42；R977.6

2016-02-03，

2016-03-04

四川省衛生廳科研課題（No 120320）

曹莉莎（1987-），女，碩士，藥師，研究方向：神經精神藥理學及蛋白質組學，E-mail：285714739@qq.com；王繼生（1974-），男，博士，主任藥師，碩士生導師，研究方向：神經精神藥理學與藥物蛋白質組學，通訊作者，E-mail：24475434@qq.com