二甲雙胍對2型糖尿病模型大鼠腎組織AGEs表達的影響

李業瓊，葉山東，翟麗敏，胡　聞（安徽醫科大學附屬省立醫院.內分泌科、.病理科，安徽合肥　3000）

二甲雙胍對2型糖尿病模型大鼠腎組織AGEs表達的影響

李業瓊1，葉山東1，翟麗敏1，胡聞2
（安徽醫科大學附屬省立醫院1.內分泌科、2.病理科，安徽合肥230001）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.042.html

目的觀察二甲雙胍（MET）對2型糖尿病（T2DM）模型大鼠腎組織非酶糖基化終末產物（AGEs）及其受體（RAGE）mRNA表達的影響，探討MET對糖尿病腎病的保護機制。方法用高脂飼料喂養結合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）建立2型糖尿病大鼠模型。模型大鼠隨機分組，給予二甲雙胍干預治療（MET組，300 mg·kg-1·d-1）、格列本脲干預（GLY組，5 mg·kg-1· d-1），并設立糖尿病模型組（T2DM組）和正常對照組（NC組）。給藥8周后，觀察各組大鼠血糖（BG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）、尿白蛋白和尿AGEs排泄的情況；免疫組化測腎小球AGEs蛋白表達；Real-time PCR檢測腎組織RAGE mRNA表達。結果8周末，MET組及GLY組BG、HbA1c、FINS、尿白蛋白/尿肌酐（UACR）、基底膜厚度（GBMT）明顯低于T2DM組，高于NC組（P＜0.05），MET組與GLY組BG、HbA1c和FINS差異無統計學意義（P＞0.05）；MET組尿AGEs/尿肌酐（UGCR）、腎組織AGEs蛋白和RAGE mRNA表達明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05），但比NC組高（P＜0.05）；MET組UGCR、腎組織AGEs和RAGE mRNA表達低于GLY組（P＜0.05）。結論MET可減少AGEs在糖尿病大鼠腎組織的積累，并下調糖尿病大鼠腎組織RAGE mRNA的過度表達，該作用可能與其腎臟保護作用有關。

2型糖尿病；糖尿病腎病；二甲雙胍；AGEs；RAGE；格列本脲

在慢性高糖狀態非酶糖基化終末產物（advanced glyclation end-products，AGEs）形成增加，并且AGEs多肽在糖尿病患者的腎臟中清除受到影響，導致體內AGEs水平的進一步升高，AGEs在腎臟局部組織的積聚可通過多種直接和間接的機制導致腎臟損傷［1］，在糖尿病腎病的發生中發揮重要的作用。二甲雙胍（metformin，MET）作為治療2型糖尿病的一線首選藥物，除降糖作用，尚可預防和延緩糖尿病腎病的發生和發展［2］。本研究通過觀察二甲雙胍對2型糖尿病大鼠腎組織AGEs的表達及經尿排泄的影響，初步探討其對腎臟保護作用及其機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器設備DFM-96型10管放射免疫計數儀，購于安徽合肥眾成機電公司；DS-5型糖化血紅蛋白檢測儀，購于英國DREW公司；胰島素放射免疫試劑盒，購于北京原子高科公司；ABI 7500型擴增儀，購于美國Bio-Rad公司；NDl000紫外/分光光度儀，購于美國Nano-Drop公司；DG-3022A型酶聯免疫檢測儀，購于江蘇南京國營華東電子管廠。

1.1.2實驗動物健康清潔級♂ SD大鼠42只，2月齡，體質量180～200 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心（scxk皖2011～002）。在飼養期間，12 h交替照明，室溫（19±1）℃，相對濕度48%，大鼠自由進食進水。

1.1.3藥物與試劑白蛋白放射免疫試劑盒，購于天津市協和公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美國Sigma公司；二甲雙胍，購于上海施貴寶公司；格列本脲（glyburide，GLY），天津太平洋公司；尿素氮、肌酐試劑盒，南京建成科技公司；AGEs免疫組化試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司；胰島素放射免疫試劑盒，購于北京原子高科公司；尿AGEs ELISA試劑盒，購于上海艾來薩生物科技公司；PCR試劑盒及引物、TRIzol均購于大連TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.12型糖尿病模型大鼠的制備健康清潔級♂SD大鼠42只，隨機分成兩組：模型組（DM組，n =33），給予高脂飲食（常規飼料加10%豬油、2%膽固醇）；正常對照組（NC組，n=9），普通飼料喂養。高脂飲食1個月后，測血漿胰島素水平（fasting insulin，FINS）和空腹血糖（fasting peripheral blood glu-cose，FBG），并且計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-Ir）［HOMA-Ir=（FBG×FINS）/22.5］。給予STZ 30 mg· kg-1（溶解于現配制的0.1 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液中，pH=4.4）腹腔內一次性注射。正常對照組大鼠注射等量枸櫞酸緩沖液。1周后測隨機血糖，血糖≥16.7 mmol·L-1，且伴胰島素抵抗者為T2DM大鼠成模標準。

1.2.2動物給藥及分組方法29只SD大鼠造模成功，將大鼠隨機分為3組：糖尿病組（T2DM組，n= 11，后期死亡1只）；二甲雙胍治療組（300 mg·kg-1·d-1，MET組，n=9）；格列本脲組（5 mg·kg-1· d-1，GLY組，n=9）。NC組及T2DM組給予等量的生理鹽水。于每日清晨灌胃給藥1次，高脂飼料，共8周。

1.2.3標本收集干預治療后8周末，對代謝籠12 h尿液進行收集，并準確計量，留取5 mL混勻后的尿液，置于-40℃冰箱待測尿肌酐（urine creatinine，Ucr）、尿白蛋白（urinary albumin，UAlb）和尿AGEs。收集尿標本后，用10%的水合氯醛對各組大鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉后行腹主動脈插管采血法收集血標本，測FBG、FINS、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）及血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。最后取雙側腎組織用生理鹽水反復灌洗除去包膜，右側腎組織放于液氮保存，用于日后做Real-time PCR；左腎制成石蠟切片，留日后觀察大鼠腎組織的病理變化。

1.3檢測指標及方法

1.3.1免疫組化測腎組織AGEs的表達載玻片防脫片處理，石蠟切片脫蠟水化，微波抗原修復，滅活內源性酶，滴加封閉液，滴加經稀釋的一抗（兔IgG 1∶200），4℃過夜，PBS洗，再滴加聚合HRP標記抗兔IgG（SV-0002）二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片，觀察。于400倍鏡下進行拍照，且每張切片取3個視野。用全自動圖像分析系統（Image pro plus 6.0）對每張圖片中陽性反應部位的累積光密度（integral optegral density，IOD）進行測定，從而得到每張切片中AGEs陽性物質的相對含量，用AGEsIOD表示。

1.3.2生化指標的檢測尿AGEs采用ELISA法，尿白蛋白采用放射免疫分析法，血尿素氮采用尿酶法，尿肌酐采用苦味酸比色法。尿AGEs和尿白蛋白排泄分別用尿AGEs肌酐比［urinary AGEs/urine creatinine，UGCR（pg·g-1）］和尿白蛋白肌酐比［urinary albumin/urine creatinine，UACR（mg·g-1）］，以排除由尿液稀釋造成的影響。

1.3.3Real-time PCR測腎組織RAGE mRNA的表達腎組織的RNA采用TRIzol法提取；取2μg的總RNA進行逆轉錄獲得cDNA；cDNA產物進行Realtime PCR。RAGE引物序列上游引物：5'-CAGGGTCACAGAAACCGG-3'，下游引物：5'-ATTCAGCTCTGCACGTTCCT-3'；β-actin引物序列上游引物：5'-GCCTTAGCCTGGACCCATAG-3'，下游引物：5'-GACCACCAATCCACACAGA-3'。使用ABI7500型擴增儀，采用20 μL反應體系熒光染料法：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火34 s；72℃延伸1 min的熱循環40次；95℃15 s、60℃1 min與95℃15 s循環1次。目的和內參片段分別同批擴增，每組均設置3個復孔，運用ΔΔCt法分析Ct值，2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達拷貝數和β-actin拷貝數的比值。

1.3.4電鏡處理透射電鏡下，取1 mm3大小的腎皮質；用2.5%戊二醛固定，制成超薄切片；將超薄切片置于高倍鏡下（×10 000）采集10個視野，并隨機觀察和測量8處腎小球基底膜的厚度（glomerular basement membrane thickness，GBMT）并取平均值。

1.4統計學處理所有數據均應用SPSS 22.0軟件進行分析，用±s表示。多組間比較運用方差分析，方差齊性者用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行兩兩比較，用SNK檢驗；方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗。

2　結果

2.1各組大鼠一般生化指標比較8周末，各組糖尿病大鼠的血BG、HbA1c、FINS及BUN水平均明顯比NC組高，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET組和GLY組上述指標明顯下降（P＜0.05），但MET組與GLY組之間BG、HbA1c值差異沒有統計學意義（P＞0.05）；而兩組之間的BUN水平差異有統計學意義（P＜0.05）。見Tab 1。

2.2各組大鼠UGCR、UACR的比較與NC組相比，各組糖尿病大鼠UGCR和UACR明顯升高，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET組和GLY組UGCR及UACR值明顯降低（P＜0.05）；與GLY組相比，MET組UGCR和UACR明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見Tab 1。

2.3各組大鼠腎組織AGEs蛋白表達的變化與NC組比較，其余各組腎組織AGEsIOD水平均明顯升高，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET組及GLY組腎組織AGEsIOD水平明顯降低，且MET較GLY組下降水平更明顯，各組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見Fig 1和Tab 2。

Tab 1　Biochemical characteristics of diabetic rats after eight weeks（±s）

Tab 1　Biochemical characteristics of diabetic rats after eight weeks（±s）

*P＜0.05 vs NC；△P＜0.05 vs T2DM；#P＜0.05 vs MET

Group　n　BG/mmol·L-1　HbA1c/%　BUN/mmol·L-1　FINS/mU·L-1　UACR/mg·g-1　UGCR/pg·g-1NC　9　4.45±1.07　4.13±0.89　6.91±2.52　17.53±3.42　0.25±0.66　44.16±7.44 T2DM　10　15.6±1.56*　12.41±0.61*　18.95±0.98*　28.16±4.98*　2.86±0.10*　188.63±13.89*MET　9　11.75±0.98*△　8.78±0.32*△　11.30±2.02*△　22.08±2.61*△　1.80±0.08*△　63.50±10.05*△GLY　9　11.78±1.43*△　8.85±1.07*△　14.03±2.55*△#　22.89±0.15*△　2.37±0.12*△#　83.16±9.13*△#

Fig 1　Immunohistochemical staining for AGEs（×400）

Fig 2　Histopathological changes of renal tissue under electron microscopy among four groups（×10 000）

2.4各組大鼠腎組織RAGE mRNA表達的變化

與NC組相比，T2DM組腎組織RAGE mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；與T2DM組相比，MET及GLY干預組腎組織RAGE mRNA表達明顯降低，且MET組腎組織RAGE mRNA表達量明顯低于GLY組（P ＜0.05）。見Tab 2。

2.5各組大鼠GBMT的變化與NC組比較，T2DM 組GBMT明顯增厚，差異有統計學意義（P＜0.05）；MET組、GLY組GBMT較T2DM組明顯減低（P＜0.05）；GLY組與MET組比較，MET組GBMT改善更明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見Fig 2和Tab 2。

Tab 2　Expressions of AGEs，RAGE mRNA and GBMT of diabetic rats after eight weeks（±s）

Tab 2　Expressions of AGEs，RAGE mRNA and GBMT of diabetic rats after eight weeks（±s）

*P＜0.05 vs NC；△P＜0.05 vs T2DM；#P＜0.05 vs MET

Group　n　GBMT/nm　AGEsIOD　RAGEmRNANC　9　106.00±10.23　11.90±2.37　1.00±0.18 T2DM　10　266.58±21.68*　116.26±19.99*　26.65±0.63*MET　9　150.98±17.25*△　37.14±14.03*△　1.67±0.66*△GLY　9　203.67±23.32*△#54.39±11.45*△#　1.96±0.03*△#

3　討論

AGEs是持續高血糖狀態下非酶糖基化反應形成的終末產物，近年來研究認為AGEs在腎臟局部堆積可通過多種直接和間接的途徑參與糖尿病腎病（DN）的發生和發展［2］。在糖尿病患者的腎臟中AGEs的大量聚集，刺激系膜細胞表面的 AGEs受體，使層黏連蛋白及其它腎小球系膜結構蛋白明顯增加，最終致系膜區擴張，腎小球基膜增厚，加速腎小球硬化［1］。本研究結果顯示，糖尿病大鼠腎組織AGEs蛋白和RAGE mRNA表達明顯增強，尿AGEs排泄明顯增加，提示糖尿病大鼠腎組織AGEs聚集增加，并誘導RAGE的表達，參與DN的發生。

二甲雙胍作為治療2型糖尿病的首選抗糖尿病藥物［3］，喬進等［4］的動物實驗結果顯示，二甲雙胍可使大鼠血清AGEs含量明顯下降。Ishibashi等［5］研究顯示，二甲雙胍可有效抑制腎小管細胞AGEs形成及其誘導的RAGE表達，進而減輕其損傷。李友元等［6］報道二甲雙胍可降低腎臟組織RAGE mR-NA的過度表達，抑制AGEs的結合位點及腎組織蛋白的非酶糖基化作用，從而阻斷AGEs與其受體作用所介導的一系列信號通路［7］。本動物實驗結果顯示：經二甲雙胍和格列本脲干預8周后，二甲雙胍干預組及格列本脲組GBMT及UACR均低于2型糖尿病模型組，MET組低于格列本脲組，但2組血糖和HbA1c水平無明顯差異，提示二甲雙胍在相似降血糖的情況下，其腎臟保護作用優于格列本脲。進一步觀察顯示二甲雙胍組糖尿病大鼠尿AGEs排泄明顯減少，腎組織AGEs蛋白表達和RAGE mRNA表達明顯降低，且其降低程度優于格列本脲組，提示二甲雙胍具有降糖之外減少2型糖尿病大鼠腎臟AGEs的形成和抑制RAGE mRNA表達的作用，進而減輕腎臟損害。二甲雙胍降低糖尿病腎組織AGEs表達的機制尚不明確，有研究者發現二甲雙胍抑制腎臟組織AGEs的形成可能與其減輕氧化應激有關［8］，而氧化應激是DN發病的中心環節［2］。近期龐若宇等［9］研究指出AGEs可以誘導細胞凋亡，而二甲雙胍可以起到抗凋亡作用，其機制可能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），抑制NF-κB的激活及活性氧族的生成有關。有研究報道二甲雙胍可以通過激活AMPK并抑制AGEs和NADPH氧化酶的生成，使體外培養的足細胞中活性氧自由基含量降低，發揮腎臟保護作用［10-11］。

本實驗初步研究結果顯示，二甲雙胍可抑制糖尿病大鼠腎臟組織蛋白非酶糖基化產物反應，降低AGEs生成和腎組織RAGE mRNA表達，該作用可能與其腎臟保護部分有關，具體機制還有待進一步研究。

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Effects of metformin on expression of renal tissue AGEs in type 2 diabetic rats

LI Ye-qiong1，YE Shan-dong1，ZHAI Li-min1，HU Wen2
（1.Dept of Endocrinology，2.Dept of Pathology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei230001，China）

AimsTo observe the influences of metformin（MET）on the expression of renal tissue advanced glyclation end-products（AGEs）protein and its receptor mRNA（RAGE mRNA）in type 2 diabetes mellitus（T2DM）model rats，and to discuss the mechanism of the MET in the treatment of diabetic nephrop-athy（DN）.MethodsThe rat model of T2DM was established by fed with high-fat diet and intraperitoneal injection of low-dose of streptozotocin（STZ）.All rats were randomly divided into metformin group（MET，300 mg·kg-1·d-1），glyburide group（GLY，5 mg·kg-1·d-1），T2DM model group（T2DM）and normal control group（NC）.After 8 weeks’observation，blood glucose（BG），glycated hemoglobin（HbA1c），blood urea nitrogen（BUN），urinary albumin，urinary AGEs and urine creatinine were detected.The expression of renal tissue AGEs was detected by immunohistochemistry assay，and the expression of RAGE mRNA was measured by real-time PCR.ResultsThe levels of BG，HbA1c， urinaryalbumin/urinecreatinine （UACR），glomerular basement membrane thickness （GBMT）in MET group and GLY group were signifi-cantly lower than those of T2DM group，while higher than those of NC group（P＜0.05），the levels of BG，FINS and HbA1c were not statistically significant between MET and GLY group（P＞0.05）.The urinary AGEs/urine creatinine（UGCR），the expressions of renal tissue AGEs and RAGE mRNA in MET group and GLY group were significantly decreased compared with those of T2DM group（P＜0.05），but higher than those of NC group（P＜0.05）.The UGCR，the expressions of AGEs and RAGE mRNA in MET group were lower than those of GLY group（P＜0.05）.ConclusionMET can reduce the accumulation of AGEs in the renal tissue，and down-regulate the over-expression of RAGE mRNA in T2DM rats.

type 2 diabetes；diabetic nephropathy；metformin；AGEs；RAGE；glyburide

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.021

A

1001-1978（2016）05-0703-05

R-332；R322.61；R587.1；R692.39；R977.15

2015-12-30，

2016-01-25

安徽省高校省級自然科學研究項目（No KJ2011A157）；安徽省自然科學基金資助項目（No 1508085SMH227）

李業瓊（1990-），女，碩士生，研究方向：糖尿病及代謝疾病，E-mail：lyq0564@163.com；葉山東（1964-），男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：糖尿病及代謝疾病，通訊作者，E-mail：ysd196406@163.com