青蒿琥酯誘導人結腸癌細胞凋亡與Wnt/β-catenin信號通路的關系研究

郭　穎，田芝瑜，符　航，孫　黎，劉　芳，羅　強，張林西（河北北方學院.病理學教研室、.臨床醫學專業0級學生、.醫學影像專業0級學生、.生命科學研究中心，河北張家口　075000）

青蒿琥酯誘導人結腸癌細胞凋亡與Wnt/β-catenin信號通路的關系研究

郭穎1，田芝瑜2，符航3，孫黎4，劉芳4，羅強4，張林西4
（河北北方學院1.病理學教研室、2.臨床醫學專業2013級學生、
3.醫學影像專業2012級學生、4.生命科學研究中心，河北張家口075000）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.044.html

目的研究青蒿琥酯（ART）對人結腸癌Lovo細胞增殖的影響和可能的分子機制。方法采用噻唑藍實驗（MTT）檢測ART對Lovo細胞的增殖抑制作用，用流式細胞術和電鏡檢測ART對細胞凋亡的影響，熒光素酶報告質粒檢測ART對Wnt/β-catenin通路中TCF4/LEF轉錄活性的影響，Western blot檢測 ART對細胞內β-catenin、GSK-3β、c-Myc以及凋亡相關蛋白caspase-3表達的影響。結果與對照組相比，ART能抑制Lovo細胞增殖，72 h、320 μmol·LART的細胞抑制率高達（78.99±1.95）%（F=898.301，P =0.000）。ART能誘導細胞凋亡，24 h、160 μmol·L-1ART的細胞早期凋亡率達到（19.00±0.05）%，同時電鏡觀察到細胞凋亡的形態學表現。ART能降低TCF4/LEF報告質粒的熒光素酶活性，24 h、160 μmol·L-1ART可使TCF4/LEF報告質粒的熒光素酶活性降至（0.36±0.30）%（F= 470.954，P＜0.01）；ART處理48 h后，GSK-3β和caspase-3呈濃度依賴性升高（P＜0.01），而β-catenin和c-Myc蛋白水平呈藥物濃度依賴性降低（P＜0.01）。結論青蒿琥酯能明顯抑制結腸癌Lovo細胞增殖，并促進其凋亡，可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路活化有關。

青蒿琥酯；結腸癌細胞；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin通路；TCF4/LEF

青蒿素作為抗瘧藥之一，是從植物青蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內酯藥物。我國著名科學家屠呦呦也因此獲得諾貝爾生理學或醫學獎，并在頒獎禮上告訴全世界“青蒿素是傳統中醫給世界的禮物”。而青蒿琥酯（artesunate，ART）作為青蒿素的衍生物之一，已在臨床普遍應用于抗瘧治療，其藥理作用較為安全穩定。國內外報道青蒿琥酯對多種腫瘤細胞有抑制作用，但對結腸癌細胞的抑制作用機制尚未明確［1］。而阻斷結腸癌細胞內Wnt/β-catenin信號通路的活化，能抑制結腸癌細胞的增殖并誘導凋亡［2］。對于青蒿琥酯誘導結腸癌細胞凋亡是否通過Wnt/β-catenin信號通路，目前尚不明確。本研究將針對細胞內Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子β-catenin、GSK-3β、TCF4/LEF及靶基因c-Myc為研究方向，探索青蒿琥酯誘導結腸癌細胞凋亡的影響機制。

1　材料與方法

1.1試劑與細胞培養人結腸癌細胞Lovo購自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院細胞資源中心。青蒿琥酯購自桂林南藥股份有限公司（批號H10930195）。Annexin V/PI凋亡試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，蛋白提取和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所，所有抗體和ECL發光試劑盒均購自Santa Cruz Biotechnology公司，熒光素酶報告基因試劑盒購自New England Biolabs（Beijing）公司。Lovo細胞培養于含10%胎牛血清的F12K培養基（購自Sigma Aldrich公司），在5%CO2、37℃溫箱中培養。

1.2實驗設計及分組分為對照組和實驗組。實驗組用 ART處理，設立20、40、80、160、240、320 μmol·L-16個濃度梯度；對照組的處理是相同體積的DMSO。

1.3MTT法評估細胞增殖將細胞按1×104密度種于96孔板，用不同濃度ART（20、40、80、160、240、320 μmol·L-1）處理，每個濃度設4個復孔，分別處理24、48、72 h后，加入MTT染液，4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，溫箱放置15 min，用酶標儀檢測570 nm波長處的OD值。細胞增殖抑制率/%=（1-實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡處于對數生長期的細胞待貼壁后，按實驗設計加入不同濃度ART （20、80、160 μmol·L-1），24 h后收集細胞，先用預冷PBS清洗2遍，然后分別滴加Annexin-V FITC和PI處理細胞（按試劑盒說明進行），最后通過流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.5透射電鏡觀察細胞形態及凋亡情況將不同濃度藥物作用細胞48 h，PBS沖洗后，用2.5%戊二醛、1%鋨酸固定細胞，常規制作透射電鏡樣本，觀察各組細胞器的超微結構變化。

1.6熒光素酶報告質粒檢測Wnt通路信號轉導的變化將處于對數生長狀態的細胞鋪于T25培養瓶中，待細胞貼壁后，用Lipofectamine轉染LEF/TCF4報告質粒（pTOP-Luc）3 μg，4 h后換液。12 h后將細胞消化并重新種于24孔板中，待細胞貼壁后，按實驗設計加入不同濃度ART（20、80、160 μmol· L-1）進行處理。24 h后，裂解細胞，收集裂解液，并按試劑盒操作說明進行熒光素酶活性測定。用BCA法測定總蛋白濃度，每組實驗重復3次，結果取平均值。

1.7Western blot法檢測凋亡相關蛋白及Wnt通路關鍵蛋白的表達將對數生長期的細胞按實驗設計加入不同濃度ART（20、80、160 μmol·L-1）進行處理，藥物作用48 h后，提取各組蛋白。采用8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，轉膜、封閉、孵育一抗、二抗、洗膜、顯影、定影、成像，上機檢測，每組實驗重復3次。

2　結果

2.1ART對Lovo細胞增殖的影響經20、40、80、160、240、320 μmol·L-1青蒿琥酯處理Lovo細胞24、48、72 h后增殖抑制率比較，不同濃度間存在差別（F=464.922，P=0.000），兩兩比較采用Bonferroni法，240、320 μmol·L-1組差異沒有統計學意義（P=0.191），其余任兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同時相的抑制率也存在差別（F= 543.781，P=0.000）；不同濃度與不同時間的抑制率差異有統計學意義（F=10.675，P=0.000），說明在不同濃度下不同時間變化的趨勢不同，提示ART能抑制Lovo細胞增殖，并在一定范圍內呈時間和劑量依賴性（Fig 1）。

2.2ART對Lovo細胞凋亡的影響用ART按不同濃度（20、80、160 μmol·L-1）處理Lovo細胞24 h后，流式細胞分析結果顯示，細胞早期凋亡率隨藥物濃度增加而增加（Fig 2A）；電鏡結果顯示，藥物處理組Lovo細胞染色質濃縮于核膜下，呈新月形、胞質空泡化，甚至出現凋亡小體等凋亡特征，提示ART能促進Lovo細胞凋亡（Fig 2B）。

2.3ART對Lovo細胞TCF4/LEF報告質粒轉錄活性的影響與陰性對照組（1.00±0.00）比較，20、80、160 μmol·L-1青蒿琥酯組TCF4/LEF活性（0.75±0.26）%、（0.53±0.15）%、（0.36± 0.30）%，呈逐漸降低的趨勢，且差異有統計學意義（F=470.954，P＜0.01）。青蒿琥酯可明顯抑制TCF4/LEF報告質粒的轉錄活性，且隨藥物濃度升高，其抑制作用也依賴性增加，表明青蒿琥酯可明顯抑制Wnt/β-catenin通路的信號轉導。

Fig 1　Proliferation inhibitory effect of artesunate on Lovo cells

2.4ART對凋亡關鍵蛋白caspase-3及通路相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，ART（20、80、160 μmol·L-1）作用48 h后，與陰性對照組比較，caspase-3由（0.63±0.07）上調至（1.07±0.04）（F=178.884，P＜0.01），GSK-3β（0.72±0.02）上調至（1.29±0.02）（F=674.568，P＜0.01），而βcatenin由（0.90±0.06）下調至（0.44±0.04）（F= 89.619，P＜0.01），c-Myc由（0.64±0.12）下調至（0.35±0.02）（F=57.240，P＜0.01）（Fig 3）。提示ART誘導細胞凋亡可能與抑制Lovo細胞Wnt/βcatenin通路有關。

3　討論

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，2012年全球約有14萬結腸癌新發病例，占所有惡性腫瘤的10%［3］，死亡率占世界惡性腫瘤第4位［4］。雖然目前對結腸癌的診斷和治療技術有了較大提高，但結腸癌的預后仍不容樂觀。而傳統植物來源的藥物在治療各種腫瘤中發揮著重要作用［5］。

青蒿素（artmisinin）是我國科學家屠呦呦在1971年首次從菊科植物黃花蒿（Aremisia annua Linn）提取的新型結構的倍半萜內酯化合物。它不僅是一種高效、低毒的抗瘧藥物，同時也具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等應用價值［6］。ART是青蒿素的衍生物之一，已有報道ART等青蒿素衍生物能對70余種腫瘤細胞有抑制作用［7-8］。結合ART毒副作用低、不產生交叉耐藥等特點，與其他化療藥物聯合應用，有望在腫瘤治療中提高化療藥物的療效［9］。本研究表明，ART對人Lovo細胞的增殖有明顯抑制作用，且能誘導Lovo細胞早期凋亡，電鏡結果顯示經ART處理48 h后的Lovo細胞呈現細胞凋亡典型變化，而誘導凋亡可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

Fig 2　Effects of artesunate on apoptosis in Lovo cells

Fig 3　Effects of artesunate on different kinds of proteins in Lovo cells after 48 h

Wnt/β-catenin信號通路關鍵的正性調控因子是β-catenin（β-cat），在生理狀態下主要在細胞膜上表達，介導同型細胞之間的黏連。磷酸化肌醇3激酶β（glycogen synthase 3 kinase-β，GSK3β）是Wnt信號通路的重要負性調控因子，與胞質內Axin、APC等結合成“破壞復合體”（destruction complex），與βcat結合，并促進其磷酸化，使β-cat很快被蛋白酶體降解，維持細胞內β-cat的低水平狀態。腫瘤細胞內Wnt信號通路被異常激活，致β-cat不能及時降解，而由胞膜向胞質、胞核轉移，激活下游靶基因c-Myc、Cyclin D1、MMP-7等，促進腫瘤的發生發展［10-11］。有研究發現，雙氫青蒿素可通過Wnt信號通路抑制骨肉瘤細胞系體外增殖和遷移［12］，青蒿琥酯可通過Wnt信號通路抑制卵巢癌細胞的侵襲［13］，也能抑制結腸癌細胞的生長［14］，但影響機制尚需探討。

目前β-cat成為治療結腸癌藥物的重要靶點之一［15］，對Wnt信號通路的研究也多集中于β-cat的積累和入核，對下游轉錄因子TCF/LEF知之甚少。而TCF/LEF在Wnt/β-cat信號通路中起著分子開關的作用，β-cat進入細胞核后，與TCF/LEF結合形成復合物，調節下游靶基因的表達。許多腫瘤的發生發展與 TCF/LEF家族密切相關［16-18］。研究發現，在核內轉錄因子TCF/LEF未激活的情況下，APC基因可以激活半胱氨酸家族成員，如caspase-3，然后清除多聚合酶，使得細胞發生破碎，從而引起細胞凋亡。Jeong等［19］研究發現，TCF4在人多種大腸癌細胞中高表達，而正常細胞表達很低，通過藥物誘導TCF4低表達，可以抑制β-cat/TCF4轉錄活性，促進大腸癌細胞的凋亡。周密等［20］用熒光素酶報告質粒法，研究Lovo細胞中TCF4/LEF與靶基因c-Myc/Max的轉錄活性降低來說明藥物美洛昔康能明顯下調細胞Wnt/β-cat通路的信號轉導。本實驗結果顯示，ART能明顯抑制TCF4/LEF報告質粒的轉錄活性。Western blot研究發現，隨著ART濃度的升高，GSK-3β表達上調，而β-cat和c-Myc表達下調，這可能是通過GSK-3β催化活性增強，誘導破壞復合體Axin-APC-GSK-3β形成，促進β-cat降解，減少向胞核內轉移，抑制TCF4/LEF報告質粒的轉錄活性，一方面使下游靶基因c-Myc的表達減弱；另一方面能促進凋亡關鍵蛋白caspase-3表達，誘導結腸癌細胞凋亡。

總之，本實驗研究發現，青蒿琥酯能夠抑制結腸癌細胞的增殖、誘導其凋亡，可能通過上調GSK-3β，下調β-catenin和c-Myc，抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。通過體外研究我們還發現，ART能抑制結腸癌細胞侵襲和轉移［21］，下一步我們將進行體內實驗，建立結腸癌動物模型，進一步研究ART抑制結腸癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉移的分子機制。

［1］Krishna S，Ganapathi S，Ster I C，et al.A randomised，double blind，placebo-controlled pilot study of oral artesunate therapy for colorectal cancer［J］.EBioMedicine，2014，2（1）：82-90.

［2］Tan B L，Esa N M，Rahman H S，et al.Brewers'rice induces apoptosis in azoxymethane-induced colon carcinogenesis in rats via suppression of cell proliferation and the Wnt signaling pathway［J］. BMC Complement Altern Med，2014，14：304.

［3］Irving A A，Yoshimi K，Hart M L，et al.The utility of Apc-mutant rats in modeling human colon cancer［J］.Dis Model Mech，2014，7（11）：1215-25.

［4］Bochis O V，Irimie A，Pichler M，et al.The role of Skp2 and its substrate CDKN1B（p27）in colorectal cancer［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2015，24（2）：225-34.

［5］楊秋珺，周龍洋，劉映孜，等.小檗堿抑制HCT116細胞生長與Wnt/β-catenin信號的關系研究［J］.中國藥理學通報，2012，28（9）：1234-8.

［5］Yang Q J，Zhou L Y，Liu Y Z，et al.Study on the correlation between the anti-proliferation effect of berberine on HCT116 cells and Wnt/β-catenin signaling［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（9）：1234-8.

［6］Soomro S，Langenberg T，Mahringer A，et al.Design of novel artemisinin-like derivatives with cytotoxic and anti-angiogenic properties［J］.J Cell Mol Med，2011，15（5）：1122-35.

［7］Zhang P，Luo H S，Li M，et al.Artesunate inhibits the growth and induces apoptosis of human gastric cancer cells by downregulating COX-2［J］.Onco Targets Ther，2015，8：845-54.

［8］陳獻珊，韓坤元，陳鋒夏，等.青蒿琥酯對肺癌A549細胞侵襲能力及ICAM-1、MMP-9表達的影響［J］.中國肺癌雜志，2013，16（11）：567-71.

［8］Chen X S，Han K Y，Chen F X，et al.Effects of artesunate on the invasion of lung adenocarcinoma A549 cells and expression of ICAM-1 and MMP-9［J］.Chin J Lung Cancer，2013，16（11）：567 -71.

［9］Bachmeier B，Fichtner I，Killian P H，et al.Development of re-sistance towards artesunate in MDA-MB-231 human breast cancer cells［J］.PLoS One，2011，6（5）：e20550.

［10］郭穎，郝青，劉玉利，等.β-連環蛋白和E-鈣依賴性黏附素蛋白在大腸腺癌中的表達及意義［J］.中國老年學雜志，2015，35（12）：3341-2.

［10］Guo Y，Hao Q，Liu Y L，et al.The significance a of β-catenin and E-cadherin expression in colorectal adenocarcinoma［J］.Chin J Gerontol，2015，35（12）：3341-2.

［11］Lin Y U，Wu T，Yao Q，et al.LGR5 promotes the proliferation of colorectal cancer cells via the Wnt/β-catenin signaling pathway ［J］.Oncol Lett，2015，9（6）：2859-63.

［12］王文娟，趙丹，徐靜，等.雙氫青蒿素通過阻斷Wnt/βcatenin信號抑制骨肉瘤細胞系體外增殖和侵襲［J］.基礎醫學與臨床，2014，34（8）：1017-22.

［12］Wang W J，Zhao D，Xu J，et al.Dihydroartemisinin（DHA）inhibits proliferation and invasion of osteosarcoma cell line in vitro by suppressing Wnt/β-catenin signaling［J］.Basic Clin Med，2014，34（8）：1017-22.

［13］Marchion D C，Xiong Y，Chon H S，et al.Gene expression data reveal common pathways that characterize the unifocal nature of ovarian cancer［J］.Am J Obstet Gynecol，2013，209（6）：576.

［14］Cui C，Feng H，Shi X，et al.Artesunate down-regulates immunosuppression from colorectal cancer Colon26 and RKO cells in vitro by decreasing transforming growth factor β1 and interleukin-10 ［J］.Int Immunopharmacol，2015，27（1）：110-21.

［15］袁霜雪，王東旭，伍秋香，等.白藜蘆醇抑制HCT116結腸癌細胞增殖與Wnt/β-catenin的關系研究［J］.中國藥理學通報，2015，31（4）：537-41.

［15］Yuan S X，Wang D X，Wu Q X，et al.Study on the relationship between anti-proliferation effect of resveratrol on HCT116 colon cancer cells and Wnt/β-catenin［J］.Chin Pharmacol Bull，2015，31（4）：537-41.

［16］Brown-Clay J D，Shenoy D N，Timofeeva O，et al.PBK/TOPK enhances aggressive phenotype in prostate cancer via β-catenin-TCF/ LEF-mediated matrix metalloproteinases production and invasion ［J］.Oncotarget，2015，6（17）：15594-609.

［17］Wang Y，Qiu Z，Zhou B，et al.In vitro antiproliferative and antioxidant effects of urolithin A，the colonic metabolite of ellagic acid，on hepatocellular carcinomas HepG2 cells［J］.Toxicol In Vitro，2015，29（5）：1107-15.

［18］Zhang D，Wang Y，Dai Y，et al.CIZ1 promoted the growth and migration of gallbladder cancer cells［J］.Tumour Biol，2015，36 （4）：2583-91.

［19］Jeong J B，Lee J，Lee S H.TCF4 is a molecular target of resveratrol in the prevention of colorectal cancer［J］.Int J Mol Sci，2015，16（5）：10411-25.

［20］周密，何百成，央茂盛.美洛昔康抑制人結腸癌細胞增殖與Wnt/β-catenin信號的關系研究［J］.中國藥理學通報，2015，31（3）：396-400.

［20］Zhou M，He B C，Yang M S.Anti-proliferative effect of meloxicam and Wnt/β-catenin signal in colon cancer cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2015，31（3）：396-400.

［21］郭穎，郭建華，符航，等.青蒿琥酯對人大腸癌Lovo細胞侵襲影響的初步研究［J］.中國藥理學通報，2016，32（1）：60-3.

［21］Guo Y，Guo J H，Fu H，et al.Preliminary of research of artesunate on invasion of human colon cancer Lovo cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2016，32（1）：60-3.

Compared with the control group，the inhibitory rate of cell proliferation at 72 h and 320 μmol·L-1ART was （78.99±1.95）% （F=898.301，P=0.000）；the cell apoptotic rate at 24 h and 160 μmol·L-1ART was（19.00±0.05）%and morphological signs of cell apoptosis were found by EM；the transcriptional activity of TCF4/LEF at 24 h and 160 μmol·L-1ART was （0.36±0.30）%（F=470.954，P＜0.01）；the expressions of caspase-3 and GSK-3β were significantly increased，while β-catenin and c-Myc were significantly decreased when treated with different concentrations of ART for 48 h（P＜0.01）.ConclusionART may significantly inhibit proliferation and promote apoptosis of Lovo cells probably by inactivating Wnt/β-catenin pathway.

Study on the relationship between promoting apoptosis effect of artesunate and Wnt/β-catenin pathway in colon cancer cells

GUO Ying1，TIAN Zhi-yu2，FU Hang3，SUN Li4，LIU Fang4，LUO Qiang4，ZHANG Lin-xi4
（1.Dept of Pathology，2.Major of Clinical Medicine，Grade 2013，3.Major of Medical Image，Grade 2012，4.Life Science Research Center，Hebei North University，Zhangjiakou Hebei075000，China）

AimTo investigate the promoting apoptosis effect of artesunate（ART）on human colon cancer Lovo cells and its mechanisms.MethodsMTT assay was performed to determine the anti-proliferative effect of artesunate.Flow cytometry assay and electron microscopy（EM）were used to evaluate the apoptotic effect of artesunate.Luciferase reporter assay was introduced to measure the activation of Wnt/β-catenin pathway. Western blot was used to detect the pathway-related protein levels of β-catenin，GSK-3β，c-Myc and apoptosis-related protein level of casepase-3.Results

artesunate；colon cancer cells；proliferation；apoptosis；Wnt/β-catenin pathway；TCF4/LEF

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.022

A

1001-1978（2016）05-0707-05

R-332；R322.11；R329.24；R542.22；R845.22

2016-01-19，

2016-02-20

河北省高等學校科學技術研究青年基金項目（No QN2013 1078）；河北省高等學校科學技術研究重點項目（No ZD20131004）

郭穎（1982-），女，碩士，講師，研究方向：消化道腫瘤病理學，E-mail：guoyingguo2008@163.com；張林西（1968-），男，博士，教授，研究方向：消化道腫瘤病理學，E-mail：zlxwx1@163.com