中高危MDS與MDS/MPN患者骨髓單個核細胞凋亡及臨床特征比較

劉小柳　鄒立新　雷　堅　張曙輝　吳劍雄.湖南師范大學附屬長沙醫院血液腫瘤科，湖南長沙　40006；.中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院病理科，湖南長沙　40006

中高危MDS與MDS/MPN患者骨髓單個核細胞凋亡及臨床特征比較

劉小柳1鄒立新1雷堅2張曙輝1吳劍雄1
1.湖南師范大學附屬長沙醫院血液腫瘤科，湖南長沙410006；
2.中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院病理科，湖南長沙410006

目的 比較中高危骨髓增生異常綜合征（MDS）與骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤（MDS/MPN）骨髓單個核細胞（BMNCs）凋亡情況及其與患者臨床特征的關系。方法 收集2013年7月～2015年7月在湖南師范大學附屬長沙醫院血液科就診的8例中高危MDS及5例MDS/MPN患者的骨髓標本及臨床資料，AO/EB熒光雙重染色及Caspase-3活性檢測BMNCs凋亡，相關性分析細胞凋亡與患者臨床特征的關系。結果 凋亡在中高危MDS和MDS/MPN患者BMNCs中的發生率分別為（10.25±1.77）%、（6.90±1.66）%，前者高于后者（P=0.032）；Caspase-3檢測顯示，中高危MDS患者BMNCs中Caspase-3活性為（0.18±0.04）%，顯著高于MDS/MPN組［（0.07±0.02）%］，差異有統計學意義 （P=0.028）；相關性分析顯示，中高危MDS患者BMNCs凋亡率與骨髓原始細胞比例呈負相關（r=-0.81，P=0.015），而MDS/MPN凋亡率與骨髓原始細胞比例呈正相關（r=0.90，P=0.037）。結論BMNCs凋亡率、Caspase-3活性在中高危MDS和MDS/MPN中明顯不同，且BMNCs凋亡和骨髓原始細胞比例相關。

骨髓增生異常綜合征；骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤；細胞凋亡

最新WHO將慢性髓系惡性腫瘤分為三大類：骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）、骨髓增生異常/骨髓增殖性腫瘤（MDS/MPN）。MDS是一組起源于造血干細胞的異質性惡性克隆性疾病［1］，主要特征是骨髓無效造血和具有高危向急性髓系白血病演變的風險［2］。而MDS/MPN是一組臨床表現、實驗室檢查與MDS和MPN重疊的髓系惡性腫瘤，包括慢性粒單核細胞白血病（CMML）、非典型慢性髓系白血病（aCML，BCR-ABL陰性）、青少年粒單核細胞白血病（JMML）及MDS/MPN無法分類型（MDS/MPN-U）四種類型［3］。

盡管MDS作為一種血液系統疾病已被醫學界認可多年，但其發生的病理機制及疾病進展的分子基礎仍不清楚，其中，細胞凋亡失調在MDS發生發展中發揮一定作用［4］。而MDS/MPN作為一種兼有病態造血和細胞增殖性質的髓系腫瘤，其病理機制目前更是知之甚少［5］，細胞凋亡在MDS/MPN患者中的作用鮮有報道。作為兩種異質性疾病，患者骨髓細胞凋亡情況如何，尚需進一步研究確定。

為比較中高危MDS及MDS/MPN患者中的細胞凋亡發生情況，本研究以中高危MDS患者及MDS/ MPN患者的骨髓單個核細胞（BMNCs）為研究材料，分別采用細胞形態學凋亡細胞觀察、Caspase-3活性檢測方法比較兩組患者細胞凋亡情況；同時觀察了患者的臨床及實驗室檢查特征，對其細胞凋亡和臨床表型的關系進行了研究。

1　資料與方法

1.1一般資料

本研究收集2013年7月～2015年7月在湖南師范大學附屬長沙醫院血液科就診的8例中高危MDS 及5例MDS/MPN患者資料，所有病例均為初治，獲得患者知情同意。患者臨床特點見表1。8例MDS患者，依據患者臨床特征、外周血象、骨髓細胞形態學、骨髓組織病理學、細胞及分子遺傳學分析，診斷依據2006年維也納診斷標準［6］，分型依據2008WHO標準［7］，危險度分組按照最新修訂的IPSS-R標準［8］。其中，難治性貧血伴原始細胞增多-1型（RAEB-1）3例，難治性貧血伴原始細胞增多-2型（RAEB-2）5例；中危組2例，高危組3例，極高危組3例。5例MDS/MPN患者，診斷分型依據2008WHO標準［3］，其中，CMML 2例，MDS/ MPN-U 3例。

1.2方法

采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法對肝素抗凝骨髓標本進行分離，分離出的骨髓單個核細胞制成細胞懸液后分別用于細胞凋亡檢測及Caspase-3凋亡蛋白酶活性檢測。

1.2.1吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）熒光染料雙重染色法檢測細胞凋亡在熒光顯微鏡下，正常細胞核染色質著綠色，結構正常；早期凋亡細胞核染色質著綠色，但核呈固縮或串珠狀；晚期凋亡細胞核染色質著橘紅色，呈固縮狀或斑塊狀；壞死細胞為核染色質呈紅色，核結構正常［9］。鏡下每個樣本計數200個細胞，計算凋亡百分率。凋亡百分率=（凋亡細胞數/200）×100%。

1.2.2Caspase-3活性檢測 根據R&D公司提供的Caspase-3活性檢測試劑盒說明書進行。收集細胞，加入裂解液，冰上裂解10～20min，4℃12 000 r/min離心1 min，取5μL上清用Bradford法進行蛋白定量，即采用分光光度計測定OD595光密度值。另外45μL加50μL 2×反應緩沖液及5μL Caspase-3反應底物，于96孔板中 37℃避光孵育1～2 h，采用酶標儀測定OD405光密度值。按下述公式計算：Caspase-3相對活性=OD405/OD595。

表1　MDS和MDS/MPN患者的臨床特征

1.3統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；若方差不齊，則用Mann-Whitney U非參數檢驗進行統計學分析；數值變量的相關性分析采用Spearman相關分析。選擇雙向檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1中高危MDS與MDS/MPN患者BMNCs凋亡水平比較

中高危MDS組BMNCs凋亡率為（10.25±1.77）%，MDS/MPN組為（6.90±1.66）%，中高危MDS組BMNCs凋亡率高于MDS/MPN組（P=0.032）。見圖1。 2.2中高危MDS與MDS/MPN患者BMNCs中Caspase-3活性比較

圖1　MDS和MDS/MPN患者BMNCs凋亡率比較

MDS組BMNCs中Caspase-3相對活性為（0.18± 0.04）%，MDS/MPN組Caspase-3相對活性為（0.07± 0.02）%，MDS組BMNCs中Caspase-3相對活性高于MDS/MPN組（P=0.028）。見圖2。

圖2　MDS和MDS/MPN患者Caspase-3活性比較

2.3細胞凋亡與患者臨床特征的相關性分析

中高危MDS患者BMNCs凋亡率與骨髓原始細胞比例呈負相關 （r=-0.81，P=0.015）（圖3A），而MDS/MPN患者BMNCs凋亡率與骨髓原始細胞比例呈正相關（r=0.90，P=0.037）（圖3B）。但未發現患者骨髓細胞凋亡與其染色體核型異常、外周血細胞減少程度指標相關。

圖3　BMNCs凋亡與骨髓原始細胞比例的相關性分析

3　討論

染色體異常為MDS重要特點之一［10］，本研究MDS病例中也發現-7、+8、5q-核型異常；并且在MDS/MPN患者中也發現-7、+8、+9核型異常，但具體哪些基因發揮關鍵作用尚不明確，這些基因異常是疾病的始因還是伴隨表現也尚不清楚。盡管MDS和MDS/MPN被認為是獨立疾病，但患者表現出重疊的染色體異常［11］，提示兩種疾病可能存在一部分共有的發病機制。

作為一種具有增殖性質的血液系統疾病，雖有研究發現在MDS/MPN中有部分CMML和MDS/MPN-U患者存在JAK2突變［3］，但與MPN不同的是，大多數MDS/MPN的增殖與RAS/MAPK信號通路相關。本研究收集的5例MDS/MPN中，發現1例患者出現JAK2突變陽性。

目前發現細胞凋亡失調、造血微環境異常、免疫失調、表觀調節異常、染色體改變等因素參與MDS的發生發展［12-14］，其中，低危MDS表現為骨髓祖細胞凋亡的增加、進展期MDS骨髓細胞凋亡減少而增殖增加［15］，提示隨著疾病進展，克隆細胞獲得逃避凋亡信號的能力。因MDS/MPN患者整體預后較差［16］，作為比較本研究選取中高危MDS患者，通過凋亡研究發現其凋亡率約10.25%，符合大宗研究趨勢［17］，并且在中高危MDS患者中隨著骨髓原始細胞比例的增加，細胞凋亡減少。

Caspase-3在細胞凋亡中發揮重要作用，是外源性（死亡受體）和內源性（線粒體和內質網）凋亡通路的共同凋亡蛋白酶［18］，激活后通過抑制多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的活性，進而活化核酸內切酶，裂解核小體間的DNA，導致細胞凋亡［19］。本研究從形態學觀察和凋亡蛋白酶生物活性研究兩方面發現MDS患者骨髓單個核細胞凋亡發生率高于MDS/MPN患者，提示MDS/MPN是不同于MDS的另外一種血液系統克隆性疾病。

同時通過分析患者骨髓單個核細胞凋亡與患者臨床特征的關系發現，MDS患者中骨髓單個核細胞凋亡率與骨髓原始細胞比例呈反比，但MDS/MPN患者中BMNCs凋亡率卻與骨髓原始細胞比例呈正相關，考慮可能與以下因素相關：①MDS/MPN是獨立于MDS的一種髓系惡性腫瘤，細胞生物學活性不同于MDS克隆；②本研究病例數有限，尚需進一步進行臨床病例收集及研究。但本研究未發現患者細胞凋亡與其染色體核型異常、外周血細胞減少程度相關。

本研究從細胞分子水平初步比較了MDS與MDS/MPN兩類慢性髓系腫瘤中BMNCs的凋亡情況，并探討了骨髓細胞凋亡與患者臨床特征的相關性，為MDS及MDS/MPN的病理機制研究提供相關實驗依據。但MDS與MDS/MPN兩類疾病發病機制中存在共同及不同之處，細胞凋亡與增殖對MDS及MDS/ MPN患者的臨床表型、治療反應和預后的影響等問題仍需要大量臨床及實驗室研究來解決。

［1］Pang WW，Pluvinage JV，Price EA，et al.Hematopoietic stem cell and progenitor cell mechanisms in myelodysplastic syndromes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（8）：3011-3016.

［2］Tefferi A，Vardiman JW.Myelodysplastic syndromes［J］.N Engl J Med，2009，361（19）：1872-1885.

［3］Orazi A，Germing U.The myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms：myeloproliferative diseases with dysplastic features［J］.Leukemia，2008，22（7）：1308-1319.

［4］Pülhorn H，Herrmann M，Harms H，et al.Apoptotic cells and clonally expanded cytotoxic T cells in bone marrow trephines of patients with myelodysplastic syndrome［J］. Histopathology，2012，61（2）：200-211.

［5］Zoi K，Cross NC.Molecular pathogenesis of atypical CML，CMML and MDS/MPN-unclassifiable［J］.Int JHematol，2015，101（3）：229-342.

［6］Valent P，Horny HP，Bennett JM，etal.Definitions and standards in the diagnosis and treatment of the myelodysplastic syndromes：consensus statements and report from a working conference［J］.Leuk Res，2007，31（6）：727-736.

［7］Brunning RD，Orazi A，Germing U，et al.Myelodysplastic syndroms/neoplasms，overview［C］//Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.Edited by（IARC，Lyon），2008：88-93.

［8］Greenberg PL，Tuechler H，Schanz J，et al.Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes［J］.Blood，2012，120（12）：2454-2465.

［9］Piazza GA，Rahm AL，Krutzsch M，et al.Antineoplastic drugs sulindac sulfide and sulfone inhibit cell growth by inducing apoptosis［J］.Cancer Res，1995，55（14）：3110-3116.

［10］Greenberg PL.Molecularand genetic features of myelodysplasticsyndromes［J］.Int J Lab Hematol，2012，34（3）：215-222.

［11］Wu H，Bian S，Chu J，etal.Characteristics of the four subtypes of myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms［J］. Exp Ther Med，2013，5（5）：1332-1338.

［12］Tormo M，Marugán I，Calabuig M.Myelodysplastic syndromes：an update onmolecular pathology［J］.Clin Transl Oncol，2010，12（10）：652-661.

［13］Karlic H，Herrmann H，Varga F，et al.The role of epigenetics in the regulation of apoptosis in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2014，90（1）：1-16.

［14］LiW，You Y，Zou P，et al.The different immunoregulatory functions of mesenchymal stem cells in patients with low-risk or high-risk myelodysplastic syndromes［J］. PLoSOne，2012，7（9）：e45675.

［15］Xu F，He Q，Li X，et al.Rigosertib as a selective antitumor agent can amelioratemultiple dysregulated signaling transduction pathways in high-grademyelodysplastic syndrome［J］.Sci Rep，2014，4：7310.

［16］Li B，Gale RP，Xiao Z.Molecular genetics of chronic neutrophilic leukemia，chronicmyelomonocytic leukemia and atypical chronic myeloid leukemia［J］.J Hematol Oncol，2014，7：93.

［17］楊力，徐瑞容，姜勝華，等.40例骨髓增生異常綜合征染色體核型及凋亡［J］.江蘇醫藥，2010，36（10）：1135-1137.

［18］Shi J，Jiang Q，Ding X，et al.The ER stress-mediated mitochondrial apoptotic pathway and MAPKs modulate tachypacing-induced apoptosis in HL-1 atrialmyocytes ［J］.PLoSOne，2015，10（2）：e0117567.

［19］Tian H，Zhang DF，Zhang BF，et al.Melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24 induces caspase-3 denitrosylation to facilitate the activation of cancer cell apoptosis［J］.J Interferon Cytokine Res，2015，35（3）：157-167.

Comparison of apoptosis of bone marrow mononuclear cells and clinical features in patients with advanced MDS and MDS/MPN

LIU Xiaoliu1ZOU Lixin1LEIJian2ZHANG Shuhui1WU Jianxiong1
1.Department of Hematology，Changsha Hospital Affiliated to Hu'nan Normal University，Hu'nan Province，Changsha 410006，China；2.Department of Pathology，the Affiliated Tumor Hospital，Xiangya School of Medicine，Central South University，Hu'nan Province，Changsha410006，China

Objective To compare the apoptosis of bone marrow mononuclear cells （BMNCs）in myelodysplastic syndrome（MDS）and myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms（MDS/MPN），and analyze the relationship between apoptosis and clinical characteristics of patients.Methods Bone marrow specimens and clinical data of 8 cases of intermediate/high risk MDS and 5 cases of MDS/MPN patients were collected from July 2013 to July 2015 in Department of Hematology，Changsha Hospital Affiliated to Hu'nan Normal University.Acridine orange/ethidium bromide fluorescence staining and Caspase-3 activity assay were used to detect apoptosis of BMNCs，and the correlation between apoptosis and clinical characteristics of patients was analyzed.Results The apoptotic rate in intermediate/high risk MDSand MDS/MPN patients were（10.25±1.77）%，（6.90±1.66）%respectively，the former was higher than the latter（P= 0.032）.Caspase-3 activity assay showed that the Caspase-3 activity of intermediate/high risk MDSBMNCs was（0.18± 0.04）%，significantly higher than that of the MDS/MPN group［（0.07±0.02）%］，with statistically significant difference （P=0.028）.Correlation analysis showed that negative correlation was found between BMNCs apoptosis and bone marrow blast cell percentage in intermediate/high risk MDS patients（r=-0.81，P=0.015），but BMNCs apoptotic rate and the proportion of bone marrow blast cells was positively correlated in MDS/MPN patients（r=0.90，P=0.037）.Conclusion The apoptotic rate and Caspase-3 activity are significantly different in intermediate/high risk MDS and MDS/MPN，and there is a correlation between apoptotic rate and bone marrow blasts.

Myelodysplastic syndrome；Myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms；Apoptosis

R551.3

A

1673-7210（2016）01（b）-0004-04

2015-10-11本文編輯：程銘）

國家自然科學基金資助項目（81500141）。

劉小柳（1983.1-），女，博士；研究方向：惡性血液病的分子機制。