穩定過表達m icroRNA-96前列腺癌細胞株的建立及其對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響

李勇波　張孝斌　程　帆　饒　婷　余偉民武漢大學人民醫院泌尿外科，湖北武漢　430060

穩定過表達m icroRNA-96前列腺癌細胞株的建立及其對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響

李勇波張孝斌程帆饒婷余偉民
武漢大學人民醫院泌尿外科，湖北武漢430060

目的 構建穩定過表達microRNA-96（miR-96）的前列腺癌DU-145細胞株并研究其對DU-145細胞增殖和遷移的影響。方法 構建miR-96慢病毒表達載體并轉染前列腺癌細胞DU-145，嘌呤霉素篩選出穩定表達miR-96（實驗組）及陰性對照（對照組）的細胞株；通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測轉染后兩組細胞miR-96的表達；克隆形成實驗和MTT實驗檢測兩組的細胞增殖情況。transwell遷移實驗檢測兩組細胞的遷移能力。結果經過篩選后各組轉染細胞發光效率均＞90%；qRT-PCR結果顯示實驗組miR-96表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）；克隆形成實驗顯示實驗組克隆形成率明顯低于對照組（P＜0.05）；MTT實驗顯示實驗組各個時間點吸光度值均低于對照組（P＜0.05）；transwell遷移實驗表明實驗組穿膜細胞數明顯少于對照組（P＜0.05）。結論 miR-96可抑制前列腺細胞的增殖和遷移能力，可能參與前列腺癌的發生、發展。

前列腺癌；m icroRNA-96；增殖；遷移

前列腺癌是一種常見惡性泌尿系統腫瘤，全球范圍內每年約有20萬例患者死于前列腺癌［1］。前列腺癌的發病原因迄今仍不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由內源性基因編碼，長度為19～22個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA。目前，研究發現，miRNA在多種腫瘤中異常表達［2-5］，與惡性腫瘤關系密切，大約有調控miRNA編碼基因位的52%位于腫瘤相關染色體區域［6］。已有研究證明，miR-96在多種腫瘤中低表達，如：膀胱癌、乳腺癌、直腸癌等，是潛在的腫瘤抑制因子［7-11］。本實驗通過構建過表達miR-96的慢病毒載體來感染前列腺癌DU-145細胞株，以構建過表達miR-96的前列腺癌細胞穩轉細胞株，并分別進行克隆形成實驗、MTT實驗、transwell遷移實驗，研究miR-96對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響。

1　材料與方法

1.1m iR-96慢病毒質粒構建與包裝

實驗所需重組穿梭質粒LV3和包裝質粒均由上海吉瑪制藥技術有限公司制備。LV3質粒攜帶熒光蛋白表達基因及嘌呤霉素抗性基因。miR-96基因片段的導入及病毒包裝由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。基因片段序列分別如下。miR-96：5′-TTGTGCTTGATCTAACCATGT-3′；陰性對照：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′。經基因測序確定序列導入成功。

1.2細胞培養

前列腺癌細胞株：DU-145（購自中科院上海細胞庫），用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基，按常規方法培養及傳代。胎牛血清（Gib co）、青霉素和鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；1640培養基（Gibco）、0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；嘌呤霉素粉劑（北京索萊寶科技有限公司）；普通顯微鏡及熒光顯微鏡（日本Olympus）；熒光定量PCR儀（日本Olympus）。

1.3嘌呤霉素篩選濃度的確定

生理鹽水配制終濃度為0.5 g/L的嘌呤霉素溶液，并用0.22μm過濾器過濾；篩選前1 d接種5.5× 104個細胞至24孔板中，加入500μL完全培養基，37℃、5%的CO2條件下培養至細胞融合度達40%～50%；按梯度濃度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4 mg/L）嘌呤霉素溶液加入24孔板中，每隔1 d換新鮮含嘌呤霉素的溶液（濃度不變），培養3 d，使DU-145細胞全部死亡的嘌呤霉素最低濃度即為篩選濃度。嘌呤霉素的最佳篩選濃度為1.6mg/L。

1.4慢病毒載體感染前列腺癌細胞

慢病毒感染細胞前1 d接種4.0×103個DU-145細胞于96孔板中，100μL完全培養基培養，37℃、5% 的CO2條件下培養至細胞融合度達60%～70%；吸棄舊培養基，加入90μL新鮮培養基，然后加入滴度為1×107TU/mL的病毒液。24 h后更換新鮮培養基，繼續培養；48 h后熒光顯微鏡下觀察細胞發光情況。

1.5穩轉株的篩選及熒光效率檢測

慢病毒感染細胞后，待96孔板中的細胞完全融合，將細胞轉移到6孔板中培養，加入濃度為1.6 mg/L的嘌呤霉素的培養基1mL。每24小時換新鮮含篩選濃度嘌呤霉素的完全培養基，熒光顯微鏡下（200×）觀察熒光表達情況。篩選2周后獲得穩定表達細胞株。篩選培養期間根據細胞的生長狀況進行傳代。

1.6實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測m iR-96的表達

獲得穩定表達細胞株后，分別提取實驗組和對照組的RNA，RNA抽提使用QuantoBio Total RNA Isolation Kit（Tiangen公司）進行，利用PrimeScriotTMRT reagent Kit（TaKaRa公司）逆轉錄試劑盒進行cDNA第一條鏈的合成，反應條件為37℃、15min，85℃、5 s；以第一條鏈cDNA為模板，利用SYBR Green PCR MasterMix（Tiangen公司）進行PCR擴增，反應在20μL的體系中進行，擴增條件為預變性：95℃×15min，1個循環；變性：95℃×10 s，40個循環；退火/延伸：60℃×32 s，40個循環。U6 snRNA作為實驗的內參基因。miRNA相對表達量2-ΔΔCt，ΔCt=（CtmiRNA-CtU6）。逆轉錄引物為試劑盒內通用引物。擴增引物：miR-96上游：5′-TCTGGGTACCGCACTGGTAGAATTCACTG-3′；下游：5′-CCTTTCTAGACCACGGCACCATTCAGGA-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7克隆形成實驗

獲得實驗組和對照組的穩轉細胞株后，消化生長對數期細胞，調整濃度為800個/mL，取1 mL細胞分別接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養箱培養；每3天更換1次培養液。培養10 d后，吸棄每孔培養液，0.5%結晶紫染色顯微鏡下（200×）計數克隆數。每大于50個細胞的集落計數為1個克隆團，克隆形成率=（克隆團數/鋪板細胞數）×100%，實驗重復3次。

1.8MTT實驗

消化生長對數期的各組細胞，調整濃度分別為1.0×103個/mL，分別于接種后24、48、72、96 h將每孔加入MTT溶液（濃度0.5mg/mL），繼續培養箱培養4 h后吸棄孔內培養液，每孔加入150μL二甲基亞砜，37℃恒溫搖床上低速震蕩10min，使結晶物充分溶解。置于酶聯免疫檢測儀490 nm波長處測量各孔OD值，實驗重復3次。

1.9transwell遷移實驗

消化生長對數期各組細胞，無血清培養基調整細胞濃度為1.0×106個/mL，，每個小室上室加150μL細胞懸液，下室加600μL含10%血清的培養基，37℃、5%CO2培養箱培養8 h。取出小室，甲醇固定后用0.1%結晶紫染色，切下底膜移至載玻片上，用中性樹膠封片，在顯微鏡下（200×）隨機取5個視野計數穿透濾膜的細胞數，取平均值。1.10統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1實驗組與對照組熒光顯微鏡下穩轉細胞株的發光情況

經過擴大培養和嘌呤霉素篩選2周后得到穩定轉染株，熒光顯微鏡同一高倍鏡視野下觀察細胞發光情況，實驗組與對照組發光細胞數均＞90%。見圖1。

圖1　實驗組與對照組熒光顯微鏡與非熒光顯微鏡下穩轉細胞株的發光情況（200×）

2.2實驗組與對照組細胞中m iR-96的表達情況

qRT-PCR檢測實驗組和對照組中miR-96的表達情況，實驗組miR-96的表達明顯高于對照組，倍數改變為 5.937±0.129，差異有統計學意義 （P= 0.0002）。見圖2。miR-96在DU-145細胞中成功穩定過表達。

圖2　實驗組與對照組細胞中m iR-96的表達情況

2.3實驗組與對照組的克隆形成情況

培養10 d后，實驗組與對照組細胞固定染色克隆形成情況見圖3，實驗組和對照組的克隆形成率分別為（9.67±2.52）%、（30.52±4.51）%，差異有統計學意義（P=0.0034），見圖4。miR-96可以明顯抑制DU-145的克隆形成。

圖3　實驗組與對照組的克隆形成情況（結晶紫染色法,200×）

圖4　實驗組與對照組克隆形成率比較

2.4實驗組與對照組的細胞增殖情況

實驗組與對照組細胞于接種后連續4 d測吸光度值，實驗組的吸光度值分別為 0.1677±0.0047、0.2047±0.0090、0.2631±0.0083、0.3480±0.0054，對照組吸光度值分別為0.1683±0.0069、0.2790±0.0034、0.4285± 0.0031、0.4971±0.0046，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。miR-96在各個時間點均可抑制DU-145細胞的增殖。2.5實驗組與對照組的穿膜細胞情況

圖5　實驗組與對照組的細胞增殖情況

培養8 h后，固定染色，高倍顯微鏡下實驗組與對照組的穿膜細胞情況見圖6。實驗組和對照組穿膜細胞數分別為（85.00±11.52）、（190.70±13.57）個，差異有統計學意義（P=0.0052），說明miR-96可抑制DU-145細胞的遷移能力。

圖6　實驗組與對照組的穿膜細胞情況（結晶紫染色法,200×）

3　討論

近年來，大量癌性相關miRNA分子與多種信號通路或轉錄因子存在交互作用共同參與腫瘤的發生、發展。隨著對miRNA調控及腫瘤相關信號通路研究的深入，以干擾oncomiRs表達為基礎的策略將為腫瘤的治療提供廣闊的前景。miRNA可通過與靶基因mRNA的特異性堿基配對，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而調控轉錄后基因的表達［12］，能降調節其相應的蛋白編碼的靶基因。到目前為止，已有706個人類miRNA被鑒定。miRNA與多種腫瘤的發生存在密切關系，在多種癌細胞中有miRNA的異常表達或突變。miRNA既可作為抑癌基因，下調原癌基因的活性，又可作為癌基因，下調抑癌基因的活性。生物信息和實驗研究已經顯示，成千上萬的蛋白編碼的基因共同由miRNA調節。研究已表明，miRNA在人類的許多生物過程中發揮著重要作用，如代謝、分化、細胞增殖和細胞凋亡［13-14］。一些miRNA在腫瘤組織中表達異常，參與了腫瘤的發生和發展。多數在腫瘤中高表達的miRNA起著癌基因的作用，而低表達或表達缺失的miRNA在腫瘤中起抑癌基因的作用。有研究發現，失調的miRNA與腫瘤的起源和進展相關，表明miRNA在癌癥診斷和預后中可以作為一種生物標志物［15-16］。盡管對miRNA功能的理解有很大的進展，但miRNA在前列腺癌中的作用尚不清楚。

病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎發展起來的基因治療載體，其優點在于它能夠感染多種難感染的細胞，比如原代細胞、干細胞、神經元細胞等，而且慢病毒能夠將外源基因插入細胞基因組內，實現長時間、穩定表達外源基因。慢病毒介導的miRNA過表達載體的構建及其穩轉細胞株的建立，使實驗研究一勞永逸。本實驗構建過表達miR-96的慢病毒載體感染前列腺癌細胞株DU-145，從而獲得穩定過表達miR-96的穩轉細胞株。

本實驗構建的慢病毒載體的穿梭質粒帶有嘌呤霉素的抗性基因和綠色熒光蛋白（GFP）表達基因及miR-96或陰性對照基因片段。當慢病毒感染細胞后，miR-96或陰性對照基因及嘌呤霉素的抗性基因和GFP基因可整合進入宿主基因組并穩定表達。這樣宿主細胞在實現過表達miR-96或陰性對照的同時也具有嘌呤霉素抗性和表達GFP。通過嘌呤霉素分別作用于DU-145細胞，得到其最佳的篩選濃度。進行嘌呤霉素壓力篩選時未感染的細胞或嘌呤霉素基因表達缺失的細胞將會被殺死，用篩選濃度連續培養2周，同一高倍鏡視野下觀察細胞發光情況，發光細胞數均＞90%。最后分別提取了三株細胞實驗組和對照組RNA，通過qRT-PCR來檢測其miR-96的表達情況，結果顯示，實驗組miR-96的表達要明顯高于對照組，說明miR-96在細胞中成功穩定過表達。

生長快、遠處轉移和侵襲性是腫瘤細胞的特性，遠處轉移是導致晚期前列腺癌患者死亡的主要原因［17］。因此早期發現腫瘤，并抑制其生長和轉移是治療腫瘤的關鍵。近年隨著miRNA研究的不斷深入，發現大量異常表達的miRNA通過調控靶基因的表達而調節多種惡性腫瘤的發生、發展，因此大規模地篩選腫瘤發生、發展過程中異常表達的miRNA，將為人們全面認識腫瘤的生物學特性發揮重要作用［18］，也為前列腺癌的早期診治提供了新的希望。miRNA發揮生物學調控的機制為：成熟的miRNA與調節蛋白Argonaute2（Ago2）結合，進入RNA誘導的沉默復合體，通過降解靶mRNA、抑制靶mRNA翻譯或使靶mRNA脫腺苷化而發揮作用［19］。多數miRNA具有高度時序性、保守性和細胞組織特異性，同時受到發育和空間調控，從而參與細胞的增殖、分化和死亡過程［20-21］。有研究認為，miRNA可作為癌基因或抑癌基因而發揮作用，miRNA可能成為診斷腫瘤的新的分子標志和判斷腫瘤治療及預后的分子靶點［22］，miR-96通過調控不同靶基因影響多種腫瘤細胞的生物功能。Kriebel等［23］、Siu等［24］研究發現，泌尿上皮腫瘤患者血清中miR-96的水平異常，推測miR-96可能成為泌尿上皮腫瘤診斷和預后分析的腫瘤標志物。本研究通過transwell遷移實驗發現，miR-96可抑制前列腺癌細胞的遷移能力，通過細胞克隆形成實驗和MTT實驗表明，miR-96可抑制前列腺癌細胞DU-145的增殖，初步實驗表明，miR-96可調控前列腺癌細胞的生物過程，但具體調控機制有待進一步研究。

總之，成功構建了穩定過表達miR-96的前列腺癌細胞株，為以后分析miR-96對前列腺癌生物學功能影響的研究奠定了基礎。增殖實驗表明，miR-96可抑制前列腺癌細胞DU-145的增殖，為診斷和治療前列腺癌提供了新的方向。

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Establishing of microRNA-96 stable overexpression cell lines of prostatic cancer and its effect on proliferation and migration of prostatic cancer cells

LIYongbo ZHANG XiaobinCHENG FanRAO Ting YUWeimin
Department of Urology，People′s Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan 430060，China

Objective To establish microRNA-96（miR-96）stable overexpression cell lines of cervical cancer and detect its effect on proliferation of prostatic cancer cell lines DU-145.Methods Lentiviral vector stable overexpressing miR-96 was constructed and prostatic cancer cell lines DU-145 were transfected（experimental group）.The transfection cells were screened by using of puromycin and the stable transfection cell lines were obtained（control group）.Endogenous miR-96 levels in two groups were measured by quantitative RT-PCR（qRT-PCR）.The proliferation of DU-145 cells in two groups were detected by clonogenic proliferation assay and MTT assay.The migration of DU-145 cells in two groups were assessed by trans well assay.Results After screening，luminous efficiency rate of trans fection cell in each group was over 90%.qRT-PCR showed that the expression level of miR-96 in experimental group was significantly higher than that in control group（P＜0.05）.Colony formation assay showed that the clonogenicity rate of experimental group was significantly lower than that of control group（P＜0.05）.MTT assay demonstrated that absorbance values all time points of experimental group were lower than those of control group（P＜0.05）.Trans well assay revealed that the number of cells through the well in experimental group were less than that in control group（P＜0.05）.Conclusion miR-96 can inhibit proliferation and migration of prostatic cancer cells and may be involved in the development of prostatic cancer.

Prostatic cancer；MicroRNA-96；Proliferation；Migration

R737.25

A

1673-7210（2016）01（b）-0024-05

2015-06-15本文編輯：李亞聰）

李勇波（1988.5-），男，武漢大學人民醫院泌尿外科專業2013級在讀碩士研究生；研究方向：泌尿系腫瘤。

張孝斌（1944.9-），男，教授，主任醫師；研究方向：泌尿系腫瘤及結石。