改良組織塊法培養C57BL/6小鼠胰腺星狀細胞

趙朕華　王錄美　劉牧云　朱曙光　于金　趙安靜　胡良皞　滿曉華　金晶　吳洪玉 高軍　劉善榮　李兆申　廖專

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·論著·

改良組織塊法培養C57BL/6小鼠胰腺星狀細胞

趙朕華王錄美劉牧云朱曙光于金趙安靜胡良皞滿曉華金晶吳洪玉 高軍劉善榮李兆申廖專

目的通過改良傳統組織塊法培養C57BL/6小鼠胰腺星狀細胞(PSCs)，建立一種簡便易行、快速獲得大量小鼠PSCs的培養方法。方法分離C57BL/6小鼠胰腺組織，經胎牛血清清洗后剪切成0.5～1 mm3組織塊，經貼壁培養4 d取原代PSCs，并傳代。采用油紅O染色觀察細胞內脂滴變化，采用細胞免疫法及蛋白質印跡法檢測細胞α-SMA、Desmin表達。結果貼壁4 d的原代PSCs多呈橢圓形或星形，胞質內大量脂滴，表達α-SMA及Desmin蛋白的細胞少；傳代后細胞變大、偽足豐富，脂滴減少或消失，原代、傳代PSCs的α-SMA蛋白相對表達量分別為0.653±0.071、2.290±0.055，傳代細胞的表達顯著高于原代細胞(P<0.05)，表達Desmin蛋白的細胞數量顯著增加。結論改良組織塊法可高產和高純度地獲得小鼠靜息態和激活態兩種狀態的PSCs，可以滿足體外研究的需要。

組織培養技術；胰腺星形細胞；細胞分離；體外研究

胰腺的進行性纖維化是慢性胰腺炎(CP)的典型病理特征，胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell，PSCs)是胰腺纖維化的主要效應細胞，在CP的發病機制中至關重要，成功分離和培養PSCs是體外研究CP的重要前提。目前，分離和培養PSCs的經典方法是酶消化聯合梯度離心法，但該操作繁瑣、不易掌握、耗時耗力、細胞得率低，影響實驗進程。1998年Bachem等[1]首次提出采用組織塊法分選PSCs，但僅成功分離人源性和鼠源性CP組織中的PSCs，且以活化細胞為主，而正常大鼠PSCs分離失敗。近年來國內外學者報道了組織塊法培養靜息態PSCs的研究，但需借助外源性胰酶抑制劑、梯度離心分選或酶消化法[2-4]。本研究改進了已報道的組織塊法，建立一種簡單易行、利用率高、能分離正常小鼠靜止態和活化態兩種PSCs的培養方法，現報道如下。

材料和方法

一、實驗動物及試劑

清潔級雄性C57BL/6小鼠，體重20 g左右，購自第二軍醫大學實驗動物中心。胰酶購自美國Sigma公司，油紅O染料購自上海普飛生物技術有限公司，兔抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、兔抗小鼠結蛋白(Desmin)、兔抗小鼠CK19均購自美國Abcam公司，HRP標記的羊抗兔IgG購自臺灣Arigo公司，FITC標記的羊抗兔IgG及DNA Marker購自上海威奧生物科技有限公司，BCA Protein Assay Kit購自美國Pierce公司， PVDF膜購自上海賽戈生物科技有限公司，超敏ECL化學發光液購自上海賽戈生物科技有限公司。

二、方法

1．PSCs分離：用乙醚麻醉小鼠后，75%乙醇浸泡小鼠腹部消毒5 min，剖腹取出胰腺，在含有青、鏈霉素的胎牛血清中清潔后，反復剪切組織至0.5～1 mm3，然后將組織塊均勻鋪在培養皿中，每個組織塊間距為0.2～0.5 cm，倒置于孵育箱15～30 min。待組織塊貼壁后，沿培養皿邊緣緩慢加入適量含15%胎牛血清和青、鏈霉素的DMEM，置37℃、5% CO2的孵育箱培養，3 d換液一次。

2．PSCs傳代培養：組織塊培養4 d后，貼壁生長的細胞密度達40%～60%，此為原代PSCs。用一次性巴氏滴管輕柔吹打組織塊，待組織塊離壁后，和培養液一起轉移至15 ml離心管，1 500 r/min離心5 min，棄培養液，加入適量胎牛血清，1 500 r/min離心5 min，棄血清，將組織塊置新培養皿重新貼壁培養。已有原代PSCs貼壁的原培養皿加入新鮮培養液繼續培養至第7～8天，待細胞密度達80%～90%時棄培養液，PBS洗滌細胞2次，將500 μl PBS和500 μl胰酶混合均勻后加入培養皿，輕輕搖動15～20 s后吸除胰酶溶液，置入37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱內消化2 min，顯微鏡下觀察到星形貼壁細胞變圓后立即加適量培養液終止消化，用1 ml移液槍輕柔吹打，使細胞脫壁并分散成單個細胞，按2∶3比例傳代，傳代第2天換液，之后每2～3 d換液。

3．PSCs鑒定：倒置顯微鏡觀察PSCs的形態結構，主要包括細胞形狀、胞內脂滴、細胞核等。

脂滴觀察采用油紅O染色。應用4%多聚甲醛固定原代或傳代PSCs 30 min，PBS漂洗3遍后加入油紅O染液常溫染色20 min，PBS漂洗3遍，60%乙醇分化，顯微鏡下觀察背景清晰后，PBS漂洗3遍，封片，鏡下觀察并攝片。

α-SMA檢測采用細胞免疫化學法。應用4%多聚甲醛固定原代或傳代PSCs 30 min，PBS漂洗3遍后加入0.5% Triton X-100 37℃孵育30 min，5% BSA室溫封閉30 min，加α-SMA一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗后加HRP標記IgG室溫孵育80 min，DAB顯色，梯度乙醇脫水后封片，鏡下觀察并攝片。同時采用蛋白質印跡法常規檢測原代或傳代PSCs的α-SMA蛋白表達，以GAPDH為內參。應用Amersham imager 600軟件獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

Desmin檢測采用細胞免疫熒光法。方法基本同上，二抗為FITC標記IgG，最后加DAPI避光孵育5 min，核復染，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下避光攝片。

三、統計學處理

結　　果

一、PSCs形態學觀察

組織塊貼壁第4天，原代PSCs細胞呈放射狀爬出，在組織塊周圍形成“生長暈”，組織塊近側細胞多呈圓形、橢圓形，遠側細胞呈三角、四角、五角等多種星形，細胞胞質內可見高亮環形脂滴，越靠近胞核處脂滴越多；傳代后的細胞體積增大，扁平，立體感消失，偽足豐富，呈“星芒狀”，脂滴減少或消失，胞核較大，核仁明顯，呈“魚眼樣”(圖1)。油紅O染色見貼壁第4天原代細胞內脂肪滴呈紅染顆粒狀，簇集成團，環繞于胞核周圍；傳代細胞未見明顯著色(圖1)。

圖1　組織塊法分離的原代、傳代PSCs(1A、1B)及其脂滴變化(1C、1D，油紅O染色；1A、1C　100 μm，1B、1D　50 μm)

二、PSCs的α-SMA、Desmin蛋白表達

細胞免疫化學染色法見少數原代細胞α-SMA蛋白表達陽性，傳代細胞中絕大多數胞質染成棕褐色，α-SMA蛋白表達陽性，高倍鏡下見排列整齊的棕褐色肌絲(圖2)。蛋白質印跡法顯示原代、傳代PSCs的α-SMA蛋白相對表達量分別為0.653±0.071、2.290±0.055，傳代細胞的表達量顯著高于原代細胞，差異有統計學意義(t=31.498，P<0.05，圖3)。

細胞免疫熒光染色法見貼壁第4天的原代細胞和傳代細胞均有部分細胞胞質內呈現紅色熒光，傳代細胞核外紅色熒光面積大于原代細胞，并可見清晰的紅色肌絲(圖4)。

圖2　傳代PSCs α-SMA表達(細胞免疫化學染色，50 μm) 圖3　原代(1)及傳代PSCs(2)α-SMA蛋白表達(蛋白質印跡法)

圖4　原代(4A)、傳代(4B)PSCs Desmin表達(細胞免疫熒光染色　50 μm)

PSCs在CP、胰腺癌以及CP癌變等疾病的發病機制中起著至關重要的作用[5-9]。最初PSCs是在小鼠胰腺中被發現，以富含維生素A為特點[10]，后相繼在大鼠和人胰腺中分離獲得[11-12]，為胰腺相關疾病的機制研究奠定了基礎。

目前，靜息態PSCs分選主要采用酶消化聯合梯度離心法[1,12-16]，而組織塊法提取的PSCs多為激活狀態[12,17]。組織塊法分離靜息態PSCs仍需借助外源性胰酶抑制劑、梯度離心分選純化或酶消化法等，不僅成本高，而且操作繁瑣[2-4]。本研究采用改良的組織塊法分離正常小鼠PSCs，與已報道的研究相比，改用了胎牛血清清洗新鮮分離的胰腺組織，抑制胰酶消化，并及時補給組織、細胞離體后所需的營養，提高了細胞的存活率。此外，在組織塊貼壁后第2天就換液也是為了減少胰酶對組織細胞的損傷。

PSCs對胰酶的作用十分敏感，故傳代時應嚴格控制細胞與胰酶的接觸量和接觸時間。本研究在細胞傳代時將胰酶按1∶1稀釋，降低胰酶的作用濃度，并縮短細胞和胰酶的接觸時間為15～20 s，置入37℃孵育箱2 min，憑借培養皿中殘留的胰酶繼續消化細胞，成功地分離了活性好、傳代成活率高的PSCs。本方法簡便易行、細胞得率高且組織塊重復使用率高。

靜息狀態的PSCs胞質內富含脂肪滴，在活化過程中細胞形態發生改變，呈成纖維細胞樣，脂肪滴逐漸減少、消失，α-SMA表達增加[18]，而Desmin在靜息和活化狀態下均有表達，因此，脂肪滴、α-SMA和Desmin可作為鑒定PSCs的指標。脂肪滴主要用于靜息態細胞的鑒定，α-SMA用于活化細胞的鑒定[1,12,15,17-18]。本研究結果顯示，組織塊貼壁第4天在高倍顯微鏡下觀察到貼壁生長的細胞，其胞核周圍可見大量環狀高亮脂滴，油紅O染色呈現為紅染顆粒，而α-SMA低表達；細胞傳代后，脂滴消失，油紅O染色陰性，α-SMA高表達。表明組織塊法從胰腺組織中分離獲得的是靜息態PSCs，經過傳代后幾乎全部激活。

從組織塊“爬出”的早期細胞表達Desmin，傳代后同時表達Desmin和α-SMA兩種骨架蛋白，證明了改良的組織塊法可一次性分離獲得PSCs，無需梯度離心純化細胞。貼壁第4天的原代細胞有些已表達α-SMA，但傳代后表達量明顯增多，推測組織塊法培養的原代細胞中可能有小部分細胞受到胰酶消化刺激已經活化。

總之，改良的組織塊法成功分離獲得正常小鼠靜息狀態PSCs，并經傳代后活化，獲得的靜息態和激活態PSCs符合進一步實驗要求，可以滿足體外研究的需要。相比酶消化法和已報道的組織塊法，本法分選PSCs操作簡單、流程少，污染概率低，無需細胞純化及外源胰酶抑制劑干擾，且組織塊可反復貼壁分離PSC，組織利用率高。

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(本文編輯：呂芳萍)

Modified tissue culture for C57BL/6 mouse pancreatic stellate cells

ZhaoZhenhua,WangLumei,LiuMuyun,ZhuShuguang,YuJin,ZhaoAnjing,HuLianghao,ManXiaohua,JinJing,WuHongyu,GaoJun,LiuShanrong,LiZhaoshen,LiaoZhuan.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LiaoZhuan,Email:liaozhuan@smmu.edu.cn

ObjectiveTo culture C57BL/6 mouse pancreatic stellate cells (PSCs) with a modified method, and to establish a simple cultivation method with a high yield of PSCs. MethodsPancreatic tissues in C57BL/6 mice were collected, washed by fetal bovine serum, minced into 0.5～1 mm3, and cultured in sterile culture flasks. After 4days, primary PSCs were collected and passed on. The changes in intracellular lipid droplets were identified by oil red O staining; α-SMA,desmin expression was detected by immunocytochemical or immunocytofluorescent staining, and Western blot. ResultsOutgrowth cells in the fourth day were oval or star with abundant lipid droplets and fewer cells expressed α-SMA and desmin protein. PSCs turned into bigger, more pseudopodial ones with decreasing lipid droplets and significantly increasing expression of α-SMA and desmin protein after the passage. Protein expression of α-SMA in primary and passage PSCs were 0.653±0.071, 2.290±0.055, respectively; and the expression in passage PSCs was significantly higher than that in primary PSCs (P<0.05), and the number of cells expressing desmin protein was significantly increased. ConclusionsModified tissue culture is a high yield and high purity method for both quiescent and activated PSCs, which can meet the need of in-vitro studies.

Tissue cutture techniques;Pancreatic stellate cells;Cell separation;In vitro Fund program： National Natural Science Foundation of China(81270541)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.010

200433上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科(趙朕華、劉牧云、朱曙光、于金、趙安靜、胡良皞、滿曉華、金晶、吳洪玉、高軍、李兆申、廖專)，中心實驗室(王錄美、劉善榮)

廖專，Email：liaozhuan@smmu.edu.cn

國家自然科學基金(81270541)

2015-09-20)