Card9在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達及其意義

王海　楊志文　孟瀟瀟　徐萍

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·短篇論著·

Card9在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達及其意義

王海楊志文孟瀟瀟徐萍

急性胰腺炎(AP)的發病機制仍未完全闡明，其中“炎癥因子學說”[1]認為，巨噬細胞激活后釋放大量細胞因子，造成組織損傷加重，進而發展為全身炎癥反應。Card9是巨噬細胞高表達的一種新型蛋白，它作為NF-κB、p38MAPK炎癥信號通路的上游分子，能促進巨噬細胞產生、釋放炎癥因子，并在體外巨噬細胞炎性激活中起至關重要的作用[2]。本課題組前期臨床結果顯示，早期AP患者胰腺組織Card9 mRNA及蛋白表達顯著增加，且與胰腺炎嚴重程度相關[3]。本研究檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織Card9表達，探討其作用機制。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：84只健康雄性SD大鼠，鼠齡2～2.5個月，清潔級，體重160～200 g，由上海交通大學附屬上海市第一人民醫院提供和飼養，動物合格證號：SYXK(滬)2009-0086。實驗前12 h禁食，自由飲水。按隨機表法分成正常組(12只)、假手術組(36只)、ANP組(36只)。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體重方法制作ANP模型。假手術組開腹后翻動胰腺并以鈍器輕劃胰腺3次后關腹。制模后3、6、12 h分批處死大鼠，經腹主動脈采血5 ml，注入促凝管中靜置1 h，以3 000 r/min低溫離心10 min分離血清，置液氮保存備用；觀察胰腺大體病理變化后切取部分胰腺組織置液氮保存，部分胰腺組織用10%甲醛液固定過夜。正常組大鼠開腹后直接抽血、取胰腺組織。

2．檢測指標：(1)血清淀粉酶測定：由松江中心醫院檢驗科自動生化分析儀進行測定。(2)胰腺組織病理檢查：固定胰腺組織常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理改變，并采用Schimidt等[4]標準從水腫、炎癥細胞浸潤、出血和脂肪壞死程度4個方面進行評分，4個評分相加為總評分。(3)血清TNF-α、IL-1β檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測，試劑盒由eBioscience公司提供。(4)Card9 mRNA表達檢測：采用實時RT-PCR法檢測。Card9上游引物5′-TCTTTCGCAGACCCATGACA-3′，下游引物5′-GTCGTATTCCCGTGATCCCC-3′，擴增產物159 bp；內參GAPDH上游引物5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′，擴增產物187 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。取100 mg液氮固定的胰腺組織，加入1 ml Trizol抽提組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，行PCR擴增。PCR反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，ΔCt值=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtANP組-ΔCt正常組，采用公式2-ΔΔCt計算mRNA的表達量。

二、結果

1．血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平變化：ANP組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平隨造模后時間延長而逐漸升高，較同時點假手術組大鼠均顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表1)。假手術組血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平與正常組的差異無統計學意義。

表1　各組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平變化

注：與同時點假手術組比較，aP<0.05

2．胰腺組織病理改變：正常組大鼠胰腺組織結構完整，未見間質充血、出血和腺泡細胞壞死；假手術組大鼠胰腺組織結構清晰，絕大部分腺泡小葉完整，偶見炎性細胞和紅細胞浸潤，未見腺泡細胞壞死；ANP組大鼠胰腺組織可見腺泡細胞變性、壞死，小葉結構破壞、間隔增大，細胞間隙水腫，紅細胞和炎性細胞浸潤，并隨著時間延長而加重(圖1)。正常組，假手術3、6、12 h組，ANP 3、6、12 h組大鼠胰腺組織病理評分分別為(0.65±0.50)、(1.10±0.50)、(1.50±0.85)、(2.00±0.68)、(9.15±1.95)、(11.71.1.01)、(3.35±2.25)分。ANP組較同時點假手術組均顯著增高，差異有統計學意義(P值均<0.05)，而假手術組與正常組的差異無統計學意義。

圖1　正常組(1A)、假手術組(1B)、ANP 6 h組(1C)大鼠胰腺組織的病理改變(HE　×400)

3．胰腺組織 Card9 mRNA表達變化：正常組，假手術3、6、12 h組，ANP 3、6、12 h組大鼠胰腺組織Card9 mRNA表達量分別為1.0、2.03±0.89、2.50±0.60、4.17±3.54、7.71±4.34、13.35±2.66、23.72±7.67。ANP組較同時點假手術組均顯著增高，差異有統計學意義(P值均<0.05)，而假手術組與正常組的差異有無統計學意義。

4．胰腺Card9 mRNA表達量與胰腺病理評分及血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平的相關性：ANP 6、12 h組大鼠胰腺組織Card9 mRNA表達量與同時間點的胰腺組織病理評分及血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平均呈正相關(6 h時r值分別為0.898、0.817、0.862、0.721；12 h時r值分別為0.679、0.849、0.759、0.728，P值均<0.05，圖2、3)。

圖2ANP 6 h組胰腺Card9 mRNA表達量與血清淀粉酶(2A)、胰腺病理評分(2B)、血清TNF-α(2C)、IL-1β水平(2D)的相關性

圖3ANP組12 h時胰腺Card9 mRNA表達量與血清淀粉酶(3A)、胰腺病理評分(3B)、血清TNF-α(3C)、IL-1β水平(3D)的相關性

討論目前已有文獻[5-7]證實，Card9在肺結核、膀胱炎、關節炎等感染性疾病發病機制中均發揮重要作用； PPARγ激動劑能夠下調巨噬細胞Card9蛋白表達，從而抑制炎癥信號通路的激活，減少炎癥因子分泌[8]。但Card9與AP發病機制之間的聯系尚未完全闡明。本研究結果顯示，ANP組大鼠血清淀粉酶水平、胰腺病理損傷及血清TNF-α、IL-1β水平均迅速升高，且隨時間的延長逐漸增加；同時，胰腺組織Card9 mRNA表達量也隨時間的延長而逐漸增加，且與血清淀粉酶、胰腺組織病理評分、血清TNF-α和IL-1β的水平均呈正相關，表明胰腺組織Card9 mRNA表達能促進TNF-α、IL-1β的分泌，從而加重胰腺炎癥反應，與胰腺炎輕重程度成正相關[9]。

[1]Perides G, Wesis ER, Michael ES, et al. TNF-alpha-dependent regulation of acute pancreatitis severity by Ly-6C(hi) monocytes in mice[J]. J Biol Chem, 2011, 286(15):13327-13335.

[2]Roth S，Ruland J．Caspase recruitment domain-containing protein 9 signaling in innate immunity and inflammation[J]．Trends Immunol，2013，34(6)：243-250.

[3]翁成釗，徐萍，楊志文，等．急性胰腺炎早期胱天蛋白酶募集域蛋白9的動態變化及其臨床意義[J]．中華消化雜志，2015，35(1)：54-56.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1432.2015,01.021.

[4]Schimidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg, 1992, 215(1):44-56.

[5]Dejima T, Shibata K, Yamada H, et al. A C-type lectin receptor pathway is responsible for the pathogenesis of acute cyclophosphamide-induced cystitis in mice[J]. Microbiol Immunol, 2013, 57(12):833-841.

[6]Hsu YM, Zhang Y, You Y, et al. The adaptor protein CARD9 is required for innate immune responses to intracellular pathogens[J].Nat Immunol,2007,8(2)198-205.

[7]Nemeth T, Futosi K, Weisinger J, et al. Card9 mediates autoantibody-induced autoimmune diseases by linking the Syk tyrosine kinase to chemokine production[J]. Annrheumdis, 2013,205124.199.

[8]Kock G, Bringmann A, Held SA, et al. Regulation of dectin-1-mediated dendritic cell activation by peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand troglitazone[J]. Blood, 2011, 117(13):3569-3574.

[9]Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis: from biological basis to clinical evidence[J]. Shock,2007,28(2):130-140.

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.017

國家自然科學基金課題(81370569)

201600上海，南京醫科大學附屬上海松江中心醫院

徐萍，Email: sjzxxp@yeah.net

2015-07-28)