人參對胃癌SGC-7901側群細胞裸鼠移植瘤生長及Bcl-2、Bax表達的影響

錢 軍，劉 元，2，郭成旭，朱 超，承澤農

人參對胃癌SGC-7901側群細胞裸鼠移植瘤生長及Bcl-2、Bax表達的影響

錢 軍1，劉 元1，2，郭成旭1，朱 超1，承澤農3

目的 探討人參對胃癌SGC-7901側群（SP）細胞裸鼠移植瘤生長及Bcl-2、Bax表達的影響。方法 分選SP和非側群（NSP）細胞；熬制人參湯劑，制備人參含藥血清；Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax表達；建立裸鼠移植瘤模型，繪制瘤體生長曲線，計算抑瘤率；免疫組化法檢測瘤體Bcl-2、Bax的表達。結果 SP細胞生理鹽水（NS）組移植瘤體積明顯大于NSP細胞NS組（P＜0.05），NS組移植瘤體積明顯大于相應人參組，差異有統計學意義（P＜0.01），SP細胞人參組移植瘤體積與NSP細胞人參組差異無統計學意義；SP組和NSP組人參的抑瘤率分別為43.04%、31.55%；Western blot及免疫組化顯示人參可抑制移植瘤Bcl-2、誘導Bax的表達，與相應NS組比較，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結論 SP細胞的成瘤能力較NSP細胞強，人參可以抑制裸鼠移植瘤的生長，機制可能與誘導細胞凋亡相關。

側群細胞；非側群細胞；裸鼠移植瘤；人參

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.006.html

胃癌是臨床上較為常見的腫瘤，手術、化療的治療效果均不理想。研究［1-3］表明惡性腫瘤對化療不敏感的主要原因是側群細胞的高致瘤性以及對藥物的抵抗，側群細胞（side population，SP）是一類能通過ABC膜轉運體將DNA結合的Hoechst 33342燃料外排出細胞的一群細胞［4］?，F已在多種腫瘤細胞中發現SP細胞，并證明具有高增殖、高致瘤性及耐藥特性［3，5］。因此有效的干預SP細胞，可以較好地控制腫瘤的發生發展。人參是我國較為常見的傳統藥材，是五加科人參屬植物，其藥理作用表現多樣，研究［6-7］顯示人參對胃癌是有一定的治療作用并且能夠提高胃癌患者術后的生存率，但人參對胃癌SP及非側群（NSP）細胞的研究較少。該實驗采用藥物血清干預胃癌SGC7901分選細胞，觀察細胞凋亡相關蛋白的變化；建立裸鼠移植瘤模型，應用免疫組化技術，來探究人參對SP細胞的移植瘤生長及Bcl-2、Bax表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物 裸鼠購自維通利華實驗動物技術有限公司，品種品系：BALB/c-nu，SPF級，4周齡，均為雌性。新西蘭大白鼠由蚌埠醫學院動物房提供。

1.2實驗試劑及藥材 RPMI-1640不完全培養液（含有雙抗，青霉素：80 U/ml；鏈霉素：0.08 mg/ ml）、胰酶消化液、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自杭州四季青公司；Hocehst33342染料購自德國Sigma公司；維拉帕米購自上海醫藥集團有限公司；兔抗人Bcl-2一抗、兔抗人Bax一抗購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗購自韓國BIOSHARP公司；人參由蚌埠醫學院第一附屬醫院中藥房提供。

1.3方法

1.3.1人參湯劑、含藥血清的制備 取人參15 g，以去離子水煎煮，控制生藥濃度在0.2 g/ml。4℃保存備用。選擇純種新西蘭大白兔10只，約2.0 kg，隨機分為生理鹽水（NS）組和人參組，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”用藥劑量按如下公式計。家兔用藥量［g/（kg·d）］=人日用劑量×0.007/1.5［g/（kg·d）］。每組動物按等體積灌胃，每天2次，連續灌胃2周，末次灌胃前禁食不禁水12 h。末次灌胃后1 h，水合氯醛催眠大白兔，無菌心臟采血，分離收集血清，過濾除菌，EP管分裝，-20℃保存。

1.3.2細胞培養 細胞放入37℃、5%CO2、95%濕度恒溫培養箱中培養。每2 d換液1次，細胞長至90%后予以1∶3傳代。

1.3.3SP細胞的分選 取處于對數期生長的細胞，消化，4℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用4℃預冷的PBS（含2%FBS）將細胞重懸。取其中兩只離心管作為加入維拉帕米的拮抗組，余下的離心管作為實驗組，加Hoechst33342染料，培養箱中孵育、振蕩。孵育后4℃、1 000 r/min離心5 min，繼續用4℃預冷的PBS（含2%FBS）將細胞重懸至1×106/ml。流式細胞儀器中檢測分選，在350 nm波長紫外激發Hoechst33342，得到熒光呈雙重波長：藍光402～446 nm，紅光650～670 nm，分別收集SP細胞及NSP細胞。

1.3.4Western blot法檢測SP及NSP細胞Bcl-2、Bax蛋白表達 將SP、NSP細胞消化、4℃、1 000 r/ min離心5 min，分4組，SP及NSP細胞NS組、SP及NSP細胞人參組，分別加入不含人參藥物血清和含10%人參藥物血清的細胞培養液，重懸計數后轉入培養瓶，干預24、48 h后提取蛋白，BCA法定量后進行電泳、轉膜，封閉液4℃封閉4 h，分別加入1∶200稀釋的Bcl-2、Bax抗體，4℃孵育過夜，洗膜后再加入1∶6 000稀釋的二抗，4℃孵育2 h后洗膜。應用Quantity One軟件（Bio-Rad）分析掃描蛋白條帶的光密度，取目的蛋白條帶光密度值與相應β-actin光密度值之比為其相對表達量。

1.3.5裸鼠接種細胞懸液的制備 取對數期生長的SP細胞和NSP細胞，消化離心（4℃、1 000 r/ min離心5 min）后棄上清液；用PBS重懸細胞，取0.1 ml稀釋10倍；用0.4%臺盼藍染色后，血球計數板記數活細胞，當活細胞比率＞95%，稀釋細胞濃度至5×106/ml。

1.3.6裸鼠移植瘤實驗 取裸鼠20只，隨機分為2組，SP細胞組和NSP細胞組，取相應的細胞懸液并混勻，取0.2 ml接種于裸鼠右腋部偏后方皮下，再隨機分為SP細胞NS組、NSP細胞NS組和SP細胞人參組、NSP細胞人參組。于接種細胞24 h后，實驗組予以0.5 ml人參，對照組予以0.5 ml NS灌胃，每日1次。觀察裸鼠狀態和移植瘤的生長情況，每3 d測量移植瘤的長/短徑（a/b），計算瘤體體積V，V=a×b2/2；第32天處死裸鼠，剝離瘤體，稱取重量，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（NS組相對重量-相應人參組相對重量）/NS組相對重量×100%。

1.3.7免疫組化法檢測腫瘤組織中Bcl-2、Bax的表達 將瘤組織常規切片后脫蠟水化；抗原修復，用FBS代替一抗做陰性對照；加1滴3%H2O2溶液至每張切片，孵育10 min（常溫、避光）；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加1滴一抗至每張切片，常溫下孵育2 h；PBS洗3次，每次5 min；滴加1滴聚合物增強劑至每張切片，室溫下孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；滴1滴酶標抗鼠/兔聚合物至每張切片，室溫下孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加1滴新配置的DAB液至每張切片，顯微鏡下控制發色，自來水沖洗終止顯色；Mayer蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片。結果判斷：陽性細胞百分比（PP）：在400倍的顯微鏡下，選取5個不同視野，每個視野數2遍，取其平均值，作為該視野的陽性細胞數，陽性細胞數與該視野中細胞總數的比為陽性細胞百分比。然后將5個視野的陽性細胞百分比求平均值，作為該片子的PP。無陽性細胞記為0分，PP在10%以下計1分；11%～50%計2分；51%～75%計3分；75%以上計4分。染色強度（SI）：無色為0分，淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將每張切片的PP×SI得到該免疫組化的評分（IRS）［8］。

1.4統計學處理 應用SPSS 20.0軟件進行分析，數據以±s表示。單因素兩均數的比較用t檢驗，多均數間的比較用單因素方差分析。

2　結果

2.1人胃癌細胞株SGC7901中SP細胞的分選流式細胞術檢測胃癌細胞株SGC-7901中SP細胞的比例為（1.53±0.47）%，維拉帕米阻斷后SP細胞的比例降為0.1%。見圖1。

2.2含藥血清對SP、NSP細胞中Bcl-2、Bax的蛋白表達影響 Western blot結果顯示，與NSP細胞NS組比較，SP細胞NS組Bcl-2表達較高（P＜0.05），Bax無明顯差異。與SP細胞NS組比較，SP人參24 h/48 h組Bcl-2逐步降低，Bax僅在SP人參48 h組出現明顯增高（P＜0.05）；較NSP細胞NS組，NSP人參24 h/48 h組Bcl-2無明顯變化，Bax逐漸升高（P＜0.05）。Bcl-2在含藥血清干預24 h SP細胞組和NSP細胞組比較差異無統計學意義，在含藥血清干預48 h SP細胞組和NSP細胞組比較差異有統計學意義（P＜0.05），Bax含藥血清干預24 h/48 h NSP細胞組明顯高于SP細胞組（P＜0.05）。見圖2、表1。

圖1　胃癌細胞株SGC-7901 SP細胞檢測圖A：SP細胞；B：維拉帕米對照組

表1　含藥血清干預細胞后Bcl-2、Bax的表達值（n=3±s）

表1　含藥血清干預細胞后Bcl-2、Bax的表達值（n=3±s）

組別Bcl-2F值P值BaxF值P值SP細胞0.27±0.02 SP細胞人參（24 h）0.25±0.01417.26＜0.0010.29±0.00763.00＜0.001 SP細胞人參（48 h）0.05±0.020.48±0.01 NSP細胞NS0.31±0.050.29±0.04 NSP細胞人參（24 h）0.24±0.077.05＜0.050.54±0.0453.51＜0.001 NSP細胞人參（48 h）NS0.43±0.01 0.23±0.01 0.94±0.12

圖2　含藥血清干預細胞后Bcl-2、Bax的表達

2.3人參對裸鼠及移植瘤的影響 裸鼠情況均較好，實驗過程中無裸鼠死亡。各組裸鼠于接種細胞后5 d可見移植瘤。在SP及NSP細胞組中，NS組移植瘤體積均大于相應人參組，SP細胞NS組瘤體體積明顯大于NSP細胞NS組（P＜0.01，P＜0.05），SP細胞人參組與NSP細胞人參組比較差異無統計學意義，見圖3。處死裸鼠后，稱瘤體重量，SP細胞NS組、人參組瘤體重量分別為（3.09± 0.45）、（1.76±0.14）g，NSP細胞NS組、人參組瘤體重量分別為（2.06±0.06）、（1.41±0.35）g。SP細胞NS組瘤體重量大于NSP細胞NS組、SP細胞NS組，NSP細胞NS組的重量均大于相應人參組，差異有統計學意義（t=5.05、6.28、4.10，P＜0.001）；兩人參組間的比較差異無統計學意義（t=2.09，P＞0.05），計算得出SP細胞組及NSP細胞組人參的抑瘤率分別為43.04%、31.55%。見表2。

圖3　人參對胃癌分選細胞裸鼠移植瘤生長的影響A：SP細胞NS組與NSP細胞NS組裸鼠移植瘤生長曲線間的比較；B：SP細胞NS組與SP細胞人參組裸鼠移植瘤生長曲線間的比較；C：NSP細胞NS組與NSP細胞人參組裸鼠移植瘤生長曲線間的比較；D：SP細胞人參組與NSP細胞人參組裸鼠移植瘤生長曲線間的比較

2.4移植瘤組織中Bcl-2、Bax的表達 免疫組化檢測結果見圖4，各蛋白染色為黃色、深棕黃色、棕褐色不等，均在胞質內著色。Bcl-2在SP細胞NS、NSP細胞NS組的表達均高于相應人參組，并且在SP細胞NS組的表達比NSP細胞NS組高，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），兩人參組的表達差異無統計學意義。Bax在SP細胞NS組、NSP細胞NS組的表達均低于相應的人參組，在SP細胞NS組的表達比NSP細胞NS組低，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），而兩人參組的表達差異無統計學意義。見表3。

圖4　人參對腫瘤組織中Bcl-2、Bax表達的影響 SP×400A：SP細胞NS組；B：SP細胞人參組；C：NSP細胞NS組；D：NSP細胞人參組；1：Bcl-2；2：Bax

表3　各組腫瘤組織Bcl-2、Bax的IRS平均分值（n=5，±s）

表3　各組腫瘤組織Bcl-2、Bax的IRS平均分值（n=5，±s）

組別Bcl-2t值P值Baxt值P值SP細胞NS7.4±1.348.22＜0.0012.8±0.844.49＜0.01 SP細胞人參2.2±0.458.0±2.45 NSP細胞NS5.6±0.898.53＜0.0011.4±0.556.78＜0.001 NSP細胞人參1.6±0.556.0±1.41

3　討論

近些年來就中國傳統藥物對胃癌治療的研究已成為研究熱點，其原因歸結于中藥對腫瘤的治療有效、藥物副作用低、價廉等優點，隨著對中藥的不斷研究，其抗腫瘤機制也有一定的了解，如對溶酶體的影響［9］、誘導腫瘤細胞凋亡［10］、激活免疫系統間接抑制腫瘤［11］等。人參被稱為“百草之王”，是國內外著名的滋補類稀有藥材。其對多種腫瘤細胞的增殖均具有抑制作用［12］。

本實驗顯示胃癌細胞SGC7901含有少量的SP細胞，灌胃后的兔血清中含有人參的有效成分，可以應用于細胞體外實驗中；本實驗結果表明相同數量的SP細胞較NSP細胞的成瘤能力強，與研究結果［3］相符。凋亡通路主要有線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路，而最主要的是線粒體通路［13］，由Bcl-2蛋白家族引起線粒體膜通透性增加，進而引起一系列級聯反應［14］，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族成員，其比例最終決定了細胞的存亡［11］。Fan et al［15］發現SP細胞較NSP細胞有更強的抗凋亡能力與其高表達Bcl-2有關，本研究Western blot實驗結果表明SP細胞Bcl-2的表達較NSP細胞高。在人參作用于細胞不同的時間段，人參對SP細胞、NSP細胞均有一定的誘導凋亡的作用，總體表現在降低Bcl-2/Bax的比值，與實驗［11］結果一致。但人參可以更明顯地誘導NSP細胞Bax的表達，這可能與Hoechst 33342染料引起NSP細胞狀態差有關。

在免疫組化結果中，SP細胞NS組與NSP細胞NS組比較，高表達Bcl-2，低表達Bax，經人參干預后，兩細胞組Bcl-2的表達均較相應NS組低、Bax表達較NS組高，與Western實驗結果基本相符，表明SP細胞在體內具有較強的成瘤與其抗凋亡能力有一定的關系，人參可以抑制腫瘤的生長與誘導細胞凋亡存在一定的聯系。

在體外細胞層面，人參誘導NSP細胞Bax的表達較SP細胞強，而在體內實驗卻未見這種現象，這種差異可能與裸鼠的藥物代謝及轉運相關，就體內體外實驗的區別將予以進一步研究。

綜上所述，胃癌細胞SGC-7901中有少量的SP細胞，SP細胞在裸鼠成瘤方面要強于NSP細胞，這與SP細胞具有較強的抗凋亡能力有關。人參對SP、NSP細胞裸鼠成瘤具有一定的抑制作用，其機制與抑制腫瘤細胞Bcl-2，上調Bax的表達，從而誘導細胞凋亡存在一定的相關性。由于目前對于人參的研究尚處于基礎實驗階段，確切機制尚待探討，希望不久人參對胃癌的治療可以應用于臨床。

［1］ Zhao Y，Bao Q，Schwarz B，et al.Stem cell-like side populations in esophageal cancer：a source of chemotherapy resistance and metastases［J］.Stem Cells Dev，2014，23（2）：180-92.

［2］ Xie Z Y，Lv K，Xiong Y，et al.ABCG2-meditated multidrug resistance and tumor-initiating capacity of side population cells from colon cancer［J］.Oncol Res Treat，2014，37（11）：666-72.

［3］ Zhang H H，Cai A Z，Wei X M，et al.Characterization of cancer stem-like cells in the side population cells of human gastric cancer cell line MKN-45［J］.J Zhejiang Univ-Sci B，2013，14（3）：216 -23.

［4］ She J J，Zhang P G，Wang X，et al.Side population cells isolated from KATO III human gastric cancer cell line have cancer stem cell-like characteristics［J］.World J Gastroenterol，2012，18（33）：4610-7.

［5］ Xing L L，Sha Y L，Wu Y M，et al.Preliminary analysis of stem cell-like cells in human neuroblastoma［J］.World J Pediatr，2015，11（1）：54-60.

［6］ Suh S O，Kroh M，Kim N R，et al.Effects of red ginseng upon postoperative immunity and survival in patients with stage III gastric cancer［J］.Am J Chin Med，2002，30（4）：483-94.

［7］ Lee J H，Kwon K R，Cho C K，et al.Advanced cancer cases treated with cultivated wild ginseng phamacopuncture［J］.J Acupunct Meridian Stud，2010，3（2）：119-24.

［8］ 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志，1996，6（4）：229-31.

［9］ Yang N D，Tan S H，Ng S，et al.Artesunate induces cell death in human cancer cells via enhancing lysosomal function and lysosomal degradation of ferritin［J］.J Biol Chem，2014，289（48）：33425-41.

［10］Zhang Y，Bao Y L，Wu Y，et al.Alantolactone induces apoptosis in RKO cells through the generation of reactive oxygen species and the mitochondrial pathway［J］.Mol Med Rep，2013，8（4）：967 -72.

［11］Wang Y，Huang M，Sun R，et al.Extraction，characterization of a Ginseng fruits polysaccharide and itsimmune modulating activities in rats with Lewis lung carcinoma［J］.Carbohydr Polym，2015，127：215-21.

［12］Cichello S A，Yao Q，Dowell A，et al.Proliferative and inhibitory activity of siberian ginseng（Eleutherococcus senticosus）extract on cancer cell lines；A-549，XWLC-05，HCT-116，CNE and Beas-2b［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（11）：4781-6.

［13］杜 雪，糜若然.VEGF-C對宮頸癌細胞增殖和凋亡信號傳導通路的影響［J］.現代婦產科進展，2011，20（11）：877-85.

［14］Yuan S，Akey C W.Apoptosome structure，assembly，and procaspase activation［J］.Structure，2013，21（4）：501-15.

［15］Fan J，Li R，Zhang R，et al.Effect of Bcl-2 and Bax on survival of side opulation cells from hepatocellular carcinoma cells［J］. World J Gastroenterol，2007，13（45）：6053-9.

Effect of Ginseng on human gastric cancer SGC-7901 side population cells xenograft tumor in nude mice and the expression of Bcl-2，Bax

Qian Jun1，Liu Yuan1，2，Guo Chengxu2，et al
（1Dept of The Third Tumor Surgical，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000；2Dept of Graduate，Bengbu Medical College，Bengbu 233000）

Objective To explore the affection of Ginseng on the growth of humangastric cancer SGC-7901 side population（SP）cells xenografts in nude mice and expression of Bcl-2，Bax.Methods Sorting out SP cells and non-side population（NSP）cells by flow cytometry；preparation of Ginseng decoction；tumor volume were measured to draw tumor growth curves and the tumor weight inhibition rates were calculated with tumor weight.The expressions of Bcl-2，Bax were detected by immunohistochemical technology，preparation containing Ginseng drug serum，Western blot technique was used to detect the expression of Bcl-2，Bax.Results The volume of transplanted tumors in SP cells NS group was bigger than group of NSP cells NS group（P＜0.05）.The tumor volume of NS was bigger than Ginseng group（P＜0.01）.The tumor inhibitory rates in the group of Ginseng in SP cells and NSP cells were 43.04%，31.55%，respectively.The results of Western blot and immunohistochemical staining showed that Ginseng could inhibit the expression of Bcl-2 and induce the expression of Bax，the difference was statistically significant（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion The tumorigenicity of SP cells is stronger than NSP cells.Ginseng can restrain the growth of the nude mouse transplanted tumor，and the mechanism may be associated with inducing cell apoptosis.

side population cells；non-side population cells；nude mice transplantated tumor；Ginseng

R 965.2

A

1000-1492（2016）06-0773-05

2016-02-22接收

國家自然科學基金資助項目（編號：81173386）

蚌埠醫學院第一附屬醫院1腫瘤外三科、3病理科，蚌埠2330002蚌埠醫學院研究生部，蚌埠 233000

錢 軍，男，主任醫師，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：qianjun215036@sina.com